[发明专利]一种成年鸡卵原干细胞的体外分离培养方法及其应用

说明书

本发明公开了一种成年鸡卵原干细胞的体外分离培养方法及其应用，属于干细胞培养技术领域。本发明的鸡卵原干细胞的体外分离培养方法包括以下步骤：将成年鸡卵巢的皮质部分破碎成组织团块，用包含双抗的PBS缓冲液漂洗，静置后得到下层的组织团；用胰酶消化处理组织团，用磁珠活化细胞分选缓冲液进行重悬，加入一抗，孵育10‑20min；然后再加入二抗磁珠，共孵育20‑30min；用磁珠活化细胞分选缓冲液进行洗脱，收集包含目的细胞的洗脱液；将包含目的细胞的洗脱液依次进行原代培养、传代培养。本发明开创性的从成年鸡卵巢中体外分离培养得到鸡卵原干细胞，能够为延长鸡的产蛋周期、提高鸡的繁殖性能提供新的思路的途径。

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种成年鸡卵原干细胞的体外分离培养方法及其应用。

背景技术

女性的生殖衰老与卵巢功能的丧失密切相关，卵母细胞数量和质量的减少是女性生殖衰老的标志性特征。现已有大量研究支持雌性生殖系干细胞(即为卵原干细胞(OSCs))仍然具有再生潜力，其在出生后的卵巢中支持卵母细胞的更新(Germline stem cells andfollicular renewal in the postnatal mammalian ovary.Nature；Location andcharacterization of female germline stem cells(FGSCs)in juvenile porcineovary.Cell Proliferation)，这为治疗女性不孕症以及减缓卵巢老化开辟了新的有效途径。

生殖是一切生命体的基本特征之一，物种的延续必须依赖于生殖，而生殖细胞是直接执行该生物学功能的细胞。传统发育学观点认为，雌性动物的成年卵巢内不存在卵原干细胞(On regenerating the ovary and generating controversy.Cell)。随着分子生物学发展，2009年吴际教授团队首次从新生和成年的小鼠卵巢内分离出卵原干细胞并对其生物学特性进行表征(Production of offspring from a germline stem cell linederived from neonatal ovaries.Nature Cell Biology)，从而证实在成年哺乳动物卵巢中存在卵原干细胞。并利用卵原干细胞成功构建基因修饰动物模型，后通过在小鼠卵巢内追踪移植后的卵原干细胞的发育情况，发现长期培养的卵原干细胞在移植到受体的卵巢后，仍保持了其产生功能性卵母细胞和可育后代的能力。此后，研究人员在人、猪、羊、牛和兔等的卵巢组织中，都发现了卵原干细胞的标志性基因和蛋白的表达，同时这些卵巢生殖干细胞能够在体外培养条件下形成克隆并保持正常核型(In vitro differentiation ofhuman oocyte-like cells from oogonial stem cells:Single-cell isolation andmolecular characterization.Human Reproduction；Characteristics of FemaleGermline Stem Cells from Porcine Ovaries at Sexual Maturity.CellTransplantation；Further characterization of adult sheep ovarian stem cellsand their involvement in neo-oogenesis and follicle assembly.Journal ofOvarian Research；Bovine ovarian stem cells differentiate into germ cells andoocyte-like structures after culture in vitro.Reproduction in DomesticAnimals；Detection,characterization,and spontaneous differentiation in vitroof very small embryoniclike putative stem cells in adult mammalian ovary.StemCells and Development)。这些结果表明在哺乳动物中已经成功建立了较完善的卵原干细胞体外分离培养系统，并且可支撑其分化成为功能性的卵母细胞，为不孕不育及相关疾病诊治和生育力保存提供技术平台和理论依据，也为卵原干细胞的临床应用奠定基础。