[发明专利]重组载体、重组工程菌及其应用、甘油-3-磷酸氧化酶及其制备方法

权利要求书

1.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体为pBAD质粒，所述pBAD质粒携带具有以下(a)及(b)中至少一种特征的编码序列：

(a)与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有95％以上同源性；

(b)编码甘油-3-磷酸氧化酶，所述甘油-3-磷酸氧化酶的氨基酸序列包括如SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述编码序列包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

3.一种重组工程菌，其特征在于，由权利要求1-2任一项所述的重组载体转化入大肠杆菌得到。

4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)、Arctic Express(DE3)、Origami(DE3)、OneMach1^TMT1、Shuffle T7-B及Shuffle T7-K12中的一种。

5.权利要求1-2任一项所述的重组载体、或权利要求3-4任一项所述的重组工程菌在制备甘油-3-磷酸氧化酶中的应用。

6.一种甘油-3-磷酸氧化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：对权利要求3-4任一项所述的重组工程菌进行发酵培养，得到甘油-3-磷酸氧化酶。

7.根据权利要求6所述的甘油-3-磷酸氧化酶的制备方法，其特征在于，对所述重组工程菌进行发酵培养的步骤包括：

将所述重组工程菌以0.5％(v/v)-8％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中进行分批发酵，所述发酵培养基包括：5g/L-40g/L的甘油、2g/L-15g/L的酵母浸粉、10g/L-15g/L的蛋白胨、1g/L-10g/L的硫酸铵、5g/L-20g/L的磷酸二氢钾、2g/L-5g/L的三水磷酸氢二钾、2g/L-5g/L的氯化钠、0.2g/L-0.8mg/L的四水氯化锰、4mg/L-20mg/L的七水硫酸锌、0.02mg/L-0.1mg/L的二水钼酸钠、8mg/L-15mg/L的三水氯化铁，分批发酵过程中维持200rpm-750rpm的转速、0.5vvm-2vvm的通气量、35℃-38℃的发酵温度、7.00±0.10的pH、0.03MPa-0.07MPa的罐压；

当发酵液的碳源耗尽、溶氧开始回升时进行pH反馈补料发酵，pH反馈补料发酵的方式为维持所述发酵液pH值为7.00±0.10，补料发酵所用的补料培养基包括：50g/L-300g/L的甘油、50g/L-300g/L的蛋白胨、100g/L-300g/L的酵母浸粉；当发酵液OD600至20-40时，加入诱导剂进行诱导表达，得到所述甘油-3-磷酸氧化酶。

8.根据权利要求7所述的甘油-3-磷酸氧化酶的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：15g/L的甘油、8g/L的酵母浸粉、10g/L的蛋白胨、1.5g/L的硫酸铵、15.5g/L的磷酸二氢钾、4.5g/L的三水磷酸氢二钾、2.5g/L的氯化钠、0.2mg/L的四水氯化锰、10mg/L的七水硫酸锌、0.08mg/L的二水钼酸钠、8mg/L的三水氯化铁。

9.根据权利要求7-8任一项所述的甘油-3-磷酸氧化酶的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为L-阿拉伯糖，诱导表达的培养温度为20℃-37℃。

10.根据权利要求9所述的甘油-3-磷酸氧化酶的制备方法，其特征在于，所述加入诱导剂进行诱导表达的步骤包括：向所述发酵液中一次性加入终浓度2g/L-4g/L的L-阿拉伯糖，同时恒速流加浓度为50g/L-600g/L的L-阿拉伯糖，诱导表达8小时-16小时。