[发明专利]重组载体、重组工程菌及其应用、甘油-3-磷酸氧化酶及其制备方法

说明书

本发明涉及重组载体、重组工程菌及其应用、甘油‑3‑磷酸氧化酶及其制备方法。该重组载体为pBAD质粒，pBAD质粒携带具有以下(a)及(b)中至少一种特征的编码序列：(a)与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有95％以上同源性；(b)编码G3PO，G3PO的氨基酸序列包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本研究以pBAD质粒为表达载体，以甘油‑3‑磷酸氧化酶的编码序列为目的基因，得到的重组载体在宿主细胞中表达的质粒丢失率较低，性能稳定，有利于高效表达甘油‑3‑磷酸氧化酶，以便于实现甘油‑3‑磷酸氧化酶的工业化生产。本研究的重组载体在不同大肠杆菌宿主中进行表达的质粒丢失率低于10％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组载体、重组工程菌及其应用、甘油-3-磷酸氧化酶及其制备方法。

背景技术

甘油-3-磷酸氧化酶(glycerol 3-phosphate oxidase，G3PO)，国际酶分类标准号EC 1.1.3.21，是一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖型的氧化酶，能够将L-α-甘油磷酸转化为磷酸二羟丙酮，并释放出过氧化氢。临床上，甘油-3-磷酸氧化酶主要应用于检测体内甘油三酯或丙三醇的含量，对心血管疾病的预防和治疗起到重要的作用。

传统通过直接从产甘油-3-磷酸氧化酶的微生物中提取的方法，往往产量低、提取工艺复杂，难以实现大规模生产。

大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，易实现大规模发酵。通过基因工程方法，利用大肠杆菌作为宿主细胞，构建重组大肠杆菌，从而获得外源基因的表达，是一个实现工业化生产的良好途径。但工程菌往往存在质粒丢失率较高，性能不稳定，使重组蛋白的表达水平受到限制。

发明内容

基于此，有必要提供一种质粒丢失率较低的重组载体及其应用。

此外，还有必要提供一种重组工程菌及其应用、甘油-3-磷酸氧化酶及其制备方法。

一种重组载体，所述重组载体为pBAD质粒，所述pBAD质粒携带具有以下(a)及(b)中至少一种特征的编码序列：

(a)与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有95％以上同源性；

(b)编码甘油-3-磷酸氧化酶，所述甘油-3-磷酸氧化酶的氨基酸序列包括如SEQID No.2所示的氨基酸序列。

本研究利用基因工程手段，以pBAD质粒为表达载体，pBAD质粒携带具有以下(a)及(b)中至少一种特征的编码序列：(a)与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有95％以上同源性；(b)编码甘油-3-磷酸氧化酶，甘油-3-磷酸氧化酶的氨基酸序列包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，得到的重组载体在宿主细胞中进行表达的质粒丢失率较低，性能稳定，有利于高效表达甘油-3-磷酸氧化酶，以便于实现甘油-3-磷酸氧化酶的工业化生产。经试验验证，本研究的重组载体在不同大肠杆菌宿主中进行表达的质粒丢失率低于10％，重组载体性能稳定。

在其中一个实施例中，所述甘油-3-磷酸氧化酶的编码序列位于pBAD质粒中的NcoI和HindIII两限制性内切酶位点之间。

在其中一个实施例中，所述编码序列包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

一种重组工程菌，由上述重组载体转化入大肠杆菌得到。

在其中一个实施例中，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)、Arctic Express(DE3)、Origami(DE3)、OneMach1^TM T1、Shuffle T7-B及Shuffle T7-K12中的一种。

上述重组载体、或上述重组工程菌在制备甘油-3-磷酸氧化酶中的应用。