[发明专利]一种复制型dCas9-FokI系统进行高效基因编辑的方法

说明书

本发明公开了一种利用epi‑dCas9‑FokI系统进行高效基因编辑的方法，具体地公开了一种将附着体元件（EBNA1/oriP）介导融合蛋白dCas9‑FokI表达进行基因编辑的方法，所述epi‑dCas9‑FokI系统由于使用二聚形式产生切割的FokI核酸酶，因此不会破坏sgRNA的识别序列，再利用EBNA1/oriP附着体介导持续表达dCas9‑FokI核酸酶，持续切割未发生敲除的序列，达到提高敲除效率和增加对未发生目的编辑的靶位点进行重复多次编辑的目的。利用该方法可以高效敲除特定核苷酸序列，为基因功能研究提供可行的方法和强大的基因编辑工具。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种利用附着体元件EBNA1/oriP使dCas9(dead Cas9)-FokI融合蛋白持续表达从而对基因组区域进行高效敲除的方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9基因编辑系统由一个具有核酸内切酶活性的Cas9蛋白和一条单链向导RNA(single guide，sgRNA)组成。sgRNA与Cas9蛋白结合并引导Cas9蛋白靶向到靶位点进行切割，Cas9的两个切割结构域RuvC和HNH分别对DNA双链进行切割，导致双链断裂(double strand breaks，DSB)。机体自身会启动DNA修复机制，分别是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组(homology-directed repair，HR)修复机制。NHEJ是一种错配修复机制，DNA双链通过NHEJ修复会随机产生碱基插入或缺失(insertion and deletions，indels)。HR是一种精准的修复机制，在同源供体存在的情况下，供体中的外源基因片段通过同源重组方式整合到靶位点。基因编辑技术近年来发展迅速，已广泛应用于生命科学相关的各个领域，但目前的研究不远远不能满足人们的需求，例如长片段敲除的效率还比较低。而一些长片段的序列又对动物的生长发育或疾病发挥着至关重要的作用，例如长链非编码RNA(lncRNA)。在哺乳细胞中非编码区域所占比例超过了90％，并且在过去的研究中已经发现多个长非编码转录物参与骨骼肌生长发育，并且还包括许多基因调控和疾病的发生发展至关重要的顺式作用元件，因此研究工具的受限严重影响了研究人员对于长片段非编码序列的研究。

dCas9-FokI(fCas9)与以前开发的锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)相似，即将催化失活的Cas9(D10A和H840A,dCas9)与非特异的FokI限制性核酸内切酶融合表达，只有在两个引导RNA(guide RNA，sgRNA)分别靶向不同链，PAM方向相反且有一定距离的情况下才能同时招募两个没有切割活性的dCas9蛋白，两个FokI核酸酶才能形成二聚体形式，对靶位点DNA进行切割产生DSB，并且不会破坏sgRNA，因此不会破坏dCas9对靶序列的识别。众所周知，使用CRISPR/Cas9进行基因编辑时的一个不可忽视的风险就是sgRNA/Cas9复合物会产生脱靶突变，即脱靶位点与sgRNA的目标序列具有相似的序列，因此在非目标区域也会出现不理想的编辑。有研究表明通过使用成对的nCas9(D10A)进行基因编辑时，可以使脱靶风险相比于单个的野生型Cas9降低50-1500倍，因为只有当成对的sgRNAs以适合的距离同时结合到相反的链时，nCas9才能对靶位点进行切割产生一个DSB，因此降低了脱靶的可能性，dCas9-FokI与双sgRNA的nCas9具有相似的优势因此也可以达到降低脱靶风险的目的。Liu R David团队通过设计了216对sgRNA比较了5-43bp间隔长度的dCas9-FokI编辑效率后发现，当dCas9-FokI的两个sgRNA相距15-25bp时，编辑效率最高，平均能够达到约20％。