[发明专利]一种以叶片为外植体的高效构树多倍体诱导方法

权利要求书

1.一种以叶片为外植体的高效构树多倍体诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.叶片外植体预培养：以二倍体构树无菌苗叶片为外植体，接种在预培养培养基上预培养；

S2.秋水仙素诱导培养：将经预培养的外植体转接到液体秋水仙素培养基上暗培养1~4天；所述的液体秋水仙素培养基为：MS + 6-BA + IBA + 30 g/L蔗糖 + 秋水仙素，pH值为5.8~6.0，所述秋水仙素浓度为250 mg/L ~450 mg/L；

S3.组培幼苗：将暗培养后的外植体转移到不定芽诱导培养基，诱导形成不定芽；切取形成的不定芽，并转移至生根培养基中，诱导形成再生根，得到再生苗；

S4.倍数鉴定：切取所述再生根的根尖进行染色体计数，鉴定根尖染色体的倍数；

其中，步骤S1中所述的预培养培养基为：MS + 30 g/L蔗糖 + 6.0g/L琼脂，pH值为5.8-6.0；

所述不定芽诱导培养基为：MS + 1.0~2.0 mg/L 6-BA + 0.1~0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖 + 6.0g/L琼脂，pH值为5.8-6.0；

所述生根诱导基为1/2MS + 0.1~0.5 mg/L NAA + 30 g/L 蔗糖+5.0g/L琼脂，pH值为5.8-6.0。

2.根据权利要求1所述的高效构树多倍体诱导方法，其特征在于，步骤S2中暗培养的条件为：在摇床上恒温26±2℃的条件下进行培养，所述摇床的转速为90~150rpm/min。

3.根据权利要求1所述的高效构树多倍体诱导方法，其特征在于，步骤S1中，预培养的时间为3 d。

4.根据权利要求1所述的高效构树多倍体诱导方法，其特征在于，步骤S1中预培养、步骤S3中的诱导形成不定芽以及诱导生根的条件均为：温度为26±2℃，光照强度为2000lx，光照时间为12h。

5.根据权利要求1所述的高效构树多倍体诱导方法，其特征在于，步骤S4中还包括如下步骤：再将鉴定为四倍体的再生苗的叶片进行流式细胞仪检测以确定最终倍性。

6.根据权利要求1所述的高效构树多倍体诱导方法，其特征在于，步骤S3中，不定芽的切取标准为形成的不定芽长至2~5cm后；步骤S4中，所述再生根的切取标准为再生根长至1~3cm 后。

7.根据权利要求5所述的高效构树多倍体诱导方法，其特征在于，所述叶片为所述再生苗的顶部向下的第3~5片的叶片。