[发明专利]一种以叶片为外植体的高效构树多倍体诱导方法

说明书

本发明公开了一种以叶片为外植体的高效构树多倍体诱导方法，包括如下步骤：S1.以二倍体构树无菌苗叶片为外植体，接种在预培养培养基上预培养；S2.将经预培养的外植体转接到液体秋水仙素培养基上暗培养1~4天；所述的液体秋水仙素培养基含有：MS+6‑BA+IBA+蔗糖+秋水仙素，pH值为5.8~6.0，所述秋水仙素浓度为250 mg/L~550 mg/L；S3.将暗培养后的外植体转移到不定芽诱导培养基，诱导形成不定芽；切取形成的不定芽，并转移至生根培养基中，诱导形成再生根，得到再生苗；S4.鉴定根尖染色体的倍数。本发明首次建立了构树四倍体诱导体系，以期培育优质构树四倍体品种，满足构树种质资源需求。

技术领域

本发明涉及多倍体遗传育种技术领域，具体地，涉及一种以叶片为外植体的高效构树多倍体诱导方法。

背景技术

构树（Broussonetia papyrifera）为桑科（Moraceae）构树属（Broussonetia）多年生落叶乔木，其抗逆性、抗污染性强，具备生长快速、适应能力强、分布范围广、易繁殖、轮伐期短的特点，这些特性使构树在生态修复上能发挥重要作用。具体而言，构树叶片含有较高的粗蛋白含量，属优质的饲料资源，并能降低饲料成本；构树韧皮纤维细长，是造纸的高级原料，蔡伦造纸术所使用的原料主要为构树皮；由于构树叶片较厚、表面粗糙、背面有柔毛，其抗逆性、吸收有害气体（二氧化硫和氯气）和吸附粉尘的能力极强，所以常常种植构树作为绿化抗污树种。

多倍体植物通常具有器官大、有效成分含量多、抗逆抗病强等优点，在林业、农业、园艺等领域中被广泛应用。因此，研究高效诱导多倍体构树的技术，培育优质构树多倍体品种，可以改良构树品质，满足构树种质资源需求，对于其在饲料，药用，生态修复等方面具有重要的意义。而目前仍未见到培育构树多倍体的技术。

发明内容

为了弥补现有技术的空白，本发明的目的在于提供一种以叶片为外植体的高效构树多倍体诱导方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种以叶片为外植体的高效构树多倍体诱导方法，包括如下步骤：

S1.叶片外植体预培养：以二倍体构树无菌苗叶片为外植体，接种在预培养培养基上预培养；

S2.秋水仙素诱导培养：将经预培养的外植体转接到液体秋水仙素培养基上暗培养1~4天；所述的液体秋水仙素培养基含有：MS + 6-BA + IBA + 蔗糖 + 秋水仙素，pH值为5.8~6.0，所述秋水仙素浓度为250 mg/L ~550 mg/L；

S3.组培幼苗：将暗培养后的外植体转移到不定芽诱导培养基，诱导形成不定芽；切取形成的不定芽，并转移至生根培养基中，诱导形成再生根，得到再生苗；

S4.倍数鉴定：切取所述再生根的根尖进行染色体计数，鉴定根尖染色体的倍数。

进一步地，步骤S1中所述的预培养培养基包含MS + 30 g/L蔗糖 + 6.0g/L琼脂，pH值为5.8-6.0。

进一步地，所述不定芽诱导培养基包含MS + 1.0~2.0 mg/L 6-BA + 0~0.2 mg/LIBA + 30 g/L蔗糖 + 6.0g/L琼脂，pH值为5.8-6.0。

进一步地，所述生根诱导基为1/2MS + 0~0.5 mg/L NAA + 30 g/L 蔗糖+5.0g/L琼脂，pH值为5.8-6.0。

进一步地，步骤S2中暗培养的条件为：在摇床上恒温26±2℃的条件下进行培养，所述摇床的转速为90~150rpm/min。

进一步地，步骤S1中，预培养的时间为1~5 d。

进一步地，所述步骤S1中预培养、步骤S3中的诱导形成不定芽以及诱导生根的条件均为：温度为26±2℃，光照强度为2000lx，光照时间为12h。