[发明专利]一种利用米曲霉制备苔色酸的方法

权利要求书

1.一种利用米曲霉制备苔色酸的方法，其特征在于该制备方法按以下步骤进行：

步骤S1：表达质粒pRA-herA的构建；

以猴头菇的基因组DNA为模板，以P1F为正向引物、P1R为反向引物，扩增获得苔色酸合酶编码基因herA的片段一，然后以P2F为正向引物、P2R为反向引物，苔色酸合酶编码基因herA的片段一为模板，扩增获得苔色酸合酶编码基因herA的片段二；以pRA质粒经KpnI酶切线性化处理的片段为载体，将苔色酸合酶编码基因herA的片段一和片段二插入到pRA质粒中，获得表达质粒pRA-herA；

猴头菇（Hericium erinaceus）的保藏编号为CCTCC AF 2018025；

引物P1F的序列为ccgGAATTCGAGCTCGGTACCATGTCCTCCATCGCGGATACG，

引物P1R的序列为TTTATCGCGATCATGCCGGTCGTCTCCACGGCG；引物P2F的序列为ACCGGCATGATCGCGATAAACCAGGGCTC，引物P2R的序列为tactacaGATCCCCGGGTACCTCAAGCAGCAAGGCTCTCGAGG；

步骤S2：高产苔色酸菌株的获得；

取米曲霉的孢子保存液接入DPY培养基中，振荡培养2~3天，获得米曲霉菌丝体；然后加入细胞壁溶解液，振荡2~3小时，获得原生质体；向原生质体内加入缓冲液II和缓冲液III，再加入表达质粒pRA-herA，混匀后冰浴10~20 min，向混合体系加入缓冲液III，室温孵育10~20 min，然后加入缓冲液II，混匀后离心10~20 min，除去上清液后加入缓冲液II，混匀后转移到改良的察氏培养基平板上，然后加入覆盖培养基，倒置培养3~7天；待含有pRA-herA转化子长出菌丝后，利用PCR方法对其验证，对获得的阳性转化子进行2次继代培养后，获得携带有苔色酸合成酶基因的高产菌株；

每200 mL缓冲液II由1.2M山梨糖醇、50mM氯化钙溶液、50mM氯化钠溶液和10mM 氨基丁三醇组成，且pH调至7.5；每200 mL缓冲液III由质量百分含量为40%聚乙二醇-4000、50 mM氯化钙溶液和50 mM氨基丁三醇组成；所述的改良的察氏培养基按以下步骤制备：每200 mL改良的察氏培养基含有7.0 g察氏培养基、9.3 g NaCl、1.8 g (NH₄)₂SO₄、20 mg腺嘌呤、300mg甲硫氨酸和3 g琼脂粉；

步骤S3：苔色酸的制备；

将高产苔色酸菌株的菌丝接种于灭菌后的大米培养基中，对培养好的菌体进行萃取、浓缩，获得发酵液浸膏；将发酵液浸膏通过硅胶分离、高效液相色谱仪制备，得到苔色酸。

2.根据权利要求1所述的一种利用米曲霉制备苔色酸的方法，其特征在于步骤S1中将苔色酸合酶编码的基因herA片段一和片段二及经KpnI酶切线性化处理的pRA质粒片段按照（1~2）：（1~2）：2的摩尔比混合，利用多片段连接试剂盒进行连接，连接完成后将连接体系转化到大肠杆菌DH5α，过夜培养后获得阳性克隆子，最后经过PCR验证和酶切验证后，获得表达质粒pRA-herA。

3.根据权利要求1所述的一种利用米曲霉制备苔色酸的方法，其特征在于步骤S1中以pRA质粒经KpnI酶切线性化处理的片段为载体，利用非连接酶依赖型的多片段一步克隆试剂盒，将苔色酸编码基因herA的片段一和片段二插入pRA质粒中，获得表达质粒pRA- herA；pRA质粒的质量与KpnI酶的体积的比为1μg：（1~2）μL。