[发明专利]一种利用米曲霉制备苔色酸的方法

说明书

一种利用米曲霉制备苔色酸的方法，涉及微生物化学技术领域。本发明的目的是为了解决商业化的苔色酸售价高，以及传统的苔色酸制备方法存在纯度低、收率低及合成工艺复杂的问题。方法：以pRA质粒经KpnI酶切线性化处理的片段为载体，将苔色酸合酶编码基因herA的片段一和片段二插入到pRA质粒中，获得表达质粒pRA‑herA；再获得高产苔色酸菌株；将高产苔色酸菌株的菌丝接种于灭菌后的大米培养基中，对培养好的菌体进行萃取、浓缩，获得发酵液浸膏；将发酵液浸膏通过硅胶分离、高效液相色谱仪制备，得到苔色酸。本发明可获得一种利用米曲霉制备苔色酸的方法。

技术领域

本发明涉及微生物化学技术领域，具体涉及一种利用米曲霉制备苔色酸的方法。

背景技术

苔色酸(2,4-二羟基-6-甲基苯甲酸)为一种二羟基苯甲酸衍生物，以其为结构骨架的化合物具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化和抗糖尿病等生物活性，在临床药物开发方面具有潜在的应用价值。

目前，苔色酸已实现从草本植物、地衣、细菌和真菌中分离鉴定。但目前商业化的苔色酸还仅是通过化学合成的方式进行生产，售价高约1000元/100mg，并且制备方法还存在收率低、不稳定及合成工艺复杂等问题，严重制约了其在医药领域中的应用。因此需要发明一种新的制备方法来克服苔色酸现有制备技术的不足。

发明内容

本发明的目的是为了解决商业化的苔色酸售价高，以及传统的苔色酸制备方法存在纯度低、收率低及合成工艺复杂的问题，而提供一种利用米曲霉制备苔色酸的方法，成功获得可高效生产苔色酸的米曲霉菌株(苔色酸产量约0.34g/1kg)。

一种利用米曲霉制备苔色酸的方法，按以下步骤进行：

步骤S1：表达质粒pRA-herA的构建；

以猴头菇的基因组DNA为模板，以P1F为正向引物、P1R为反向引物，扩增获得苔色酸合酶编码基因herA的片段一，然后以P2F为正向引物、P2R为反向引物，苔色酸合酶编码基因herA的片段一为模板，扩增获得苔色酸合酶编码基因herA的片段二；以pRA质粒经KpnI酶切线性化处理的片段为载体，将苔色酸合酶编码基因herA的片段一和片段二插入到pRA质粒中，获得表达质粒pRA-herA；

引物P1F的序列为ccgGAATTCGAGCTCGGTACCATGTCCTCCATCGCGGATACG，引物P1R的序列为TTTATCGCGATCATGCCGGTCGTCTCCACGGCG；引物P2F的序列为ACCGGCATGATCGCGATAAACCAGGGCTC，引物P2R的序列为tactacaGATCCCCGGGTACCTCAAGCAGCAAGGCTCTCGAGG；

步骤S2：高产苔色酸菌株的获得；

取米曲霉的孢子保存液接入DPY培养基中，振荡培养2～3天，获得米曲霉菌丝体；然后加入细胞壁溶解液，温和振荡2～3小时，获得原生质体；向原生质体内加入缓冲液II和缓冲液III，再加入表达质粒pRA-herA，混匀后冰浴10～20min，向混合体系加入缓冲液III，室温孵育10～20min，然后加入缓冲液II，混匀后离心10～20min，除去上清液后加入缓冲液II，混匀后转移到改良的察氏培养基平板上，然后加入覆盖培养基，倒置培养3～7天；待含有pRA-herA转化子长出菌丝后，利用PCR方法对其验证，对获得的阳性转化子进行2次继代培养后，获得携带有苔色酸合成酶基因的高产菌株；

每200mL缓冲液II由1.2M山梨糖醇、50mM氯化钙溶液、50mM氯化钠溶液和10mM氨基丁三醇组成，且pH调至7.5；每200mL缓冲液III由质量百分含量为40％聚乙二醇-4000、50mM氯化钙溶液和50mM氨基丁三醇组成；所述的改良的察氏培养基按以下步骤制备：每200mL改良的察氏培养基含有7.0g察氏培养基、9.3g NaCl、1.8g(NH₄)₂SO₄、20mg腺嘌呤、300mg甲硫氨酸和3g琼脂粉；