[发明专利]一种稳定高效的环状RNA过表达载体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种用于环状RNA过表达的载体，其特征在于：它是连接有环状RNA成环框架的慢病毒载体；所述环状RNA成环框架来源于pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector质粒。

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述慢病毒载体为pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1；所述环状RNA成环框架的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种构建权利要求1～3任一项所述载体的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

取慢病毒载体双酶切，将酶切后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示片段与环状RNA成环框架连接，再导入大肠杆菌，提取重组质粒，即得；

所述环状RNA成环框架连接的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述慢病毒载体为pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1；所述双酶切是用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切；所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α。

5.权利要求1～3任一项所述载体在制备过表达环状RNA的重组载体或重组细胞中的用途。

6.一种过表达环状RNA的重组载体，其特征在于：它包括权利要求1～3任一项所述的载体，以及转录环状RNA的DNA片段；所述DNA片段如SEQ ID NO.4～6所示。

7.一种构建权利要求6所述过表达环状RNA的重组载体的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

取转录环状RNA的DNA片段，插入到权利要求1～3任一项所述载体中，再导入大肠杆菌，提取重组质粒，即得；

或：

取转录环状RNA的DNA片段，插入到pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector质粒的环状RNA成环框架中，再导入大肠杆菌，提取重组质粒，分别取重组质粒和慢病毒载体双酶切，将插入了DNA片段的环状RNA成环框架和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示片段连接，再导入大肠杆菌，提取重组质粒，即得；

所述环状RNA成环框架的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述载体、pcDNA3.1(+)CircRNA MiniVector质粒用HpaⅠ单酶切；所述双酶切是用XbaI和EcoRI双酶切；所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α；所述插入的方法为T4连接法或同源重组法；所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.4～6所示。

9.一种过表达环状RNA的重组细胞，其特征在于：它包含权利要求6所述过表达环状RNA的重组载体。

10.一种构建权利要求9所述过表达环状RNA的重组细胞的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

取权利要求6所述重组载体，转染细胞，即得；

所述转染细胞是先转染293T细胞，培养取病毒上清液，再转染RKO细胞。