[发明专利]一种稳定高效的环状RNA过表达载体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种用于环状RNA过表达的载体，它是连接有环状RNA成环框架的慢病毒载体；所述环状RNA成环框架来源于pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector质粒。本发明将质粒pcDNA3.1(+)CircRNA Mini VectorcircRNA成环框架剪切下来接到慢病毒载体pLVX‑EF1α‑IRES‑ZsGreen1中组成一种新的、能稳定高效过表达环状RNA的慢病毒载体pLVX‑circRNA‑ZsGreen1，经转染试验证实其在转染效率及过表达环状RNA等方面效果显著，具备实际推广应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种稳定高效的环状RNA过表达载体及其制备方法和应用。

背景技术

环状RNA(circRNA)是一种特殊的非编码RNA，其不同于线性RNA，它没有5’端和3’端，是一类通过共价闭合、首尾相连成环的单链RNA环状结构。环状RNA的成环机制主要有RNA结合蛋白(RBP)驱动的环化、内含子配对驱动的环化等。circRNA主要特点有种类多、表达丰富、稳定且不易被RNA酶降解(区别于线性)、在进化上具有高度保守性、具有细胞类型特异性和组织特异性等。circRNA的生物学功能主要包括调节基因转录、参与选择性剪接、抑制RNA成熟、参与翻译过程、促进蛋白质-蛋白质相互作用以及影响蛋白质定位。circRNA与肿瘤、神经发育、动脉粥样硬化、强直性肌营养不良等疾病的发生和进展相关，故环状RNA在新型疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。

广泛存在、丰富且进化保守的circRNA少数在细胞中高表达，大多数还是低表达，因此，通过转染过表达载体的方法使细胞过表达circRNA是研究circRNA生物学功能和机制的有力方法。目前，环状RNA的过表达载体主要有三种类型：1.基因特异的侧翼序列载体，该载体需要将以PCR分段扩增的目的环状RNA侧翼上下游各200-1000bp序列，及环状RNA序列构建到真核表达载体上，载体构建复杂，周期长，且过表达的有效性和效率难预测；2.模拟内源环化机制的通用成环框架载体，其使用上游和下游两个框架促使插入的环状RNA序列成环和剪切，因此存在着环化介导序列短，部分环状RNA难以被准确环化，过表达效率不理想，造价高的问题；3.简化的天然成环框架载体pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector，其依然存在着对于个别序列特殊、二级结构稳定复杂的环状RNA，无法准确环化过表达，由于不带荧光标记，不便于直接观察转染效率，且主要应用于瞬时转染，遗传物质随时间的延长而丢失，致使circRNA功能研究受限。

为了解决目前常用载体存在的问题，专利CN105176981B公开了一种用于环状RNA表达的载体，其转染293T的过表达效率多在250-500倍，慢病毒感染的细胞系中，过表达效率在200倍上下，过表达效率仍然较低；专利CN109097395A也公开了一种用于环状RNA表达的载体，其需要添加特定的启动子/终止子、酶切位点等，制备难度大，成本高，同时由于未验证慢病毒载体的能力，真实过表达情况不明，实际应用风险大。

由于环状RNA自身结构及生物合成的特殊性，且细胞内环境难以被有效地模仿，环状RNA的过表达受限于成环与否及成环效率，这与不同的环状RNA的序列、结构，以及过表达载体的框架、元件有关。目前，仍然缺乏准确高效、可重复、稳定生成环状RNA的过表达载体是环状RNA研究的难点和关键点。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于环状RNA过表达的载体，它是连接有环状RNA成环框架的慢病毒载体；所述环状RNA成环框架来源于pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector质粒。

进一步地，所述慢病毒载体为pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1；所述环状RNA成环框架的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种构建前述载体的方法，其特征在于：它包括如下步骤：