[发明专利]一种柑橘溃疡病诱导转录因子酵母文库、构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种柑橘溃疡病诱导转录因子酵母文库、构建方法及其应用，文库包含的转录因子为柑橘溃疡病诱导的转录因子，为柑橘在溃疡病诱导后的差异表达基因。本发明提供的柑橘溃疡病诱导转录因子酵母文库、构建方法及其应用，筛选并克隆柑橘溃疡病诱导的转录因子并构建酵母文库，可用作柑橘溃疡病调控网络的高效构建，对研究柑橘溃疡病以及其他柑橘病害，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种柑橘溃疡病诱导转录因子酵母文库、构建方法及其应用。

背景技术

近年来，柑橘产业发展却饱受柑橘溃疡病等病害的制约。柑橘溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.Citri，Xcc)引起的细菌性病害，其危害当前大多数主栽柑橘品种。因此，加强对柑橘溃疡病防控研究是柑橘产业发展的迫切需求。柑橘溃疡病防治更多寄希望于培育抗病新种质。分子育种由于可定向、高效培育抗病种质，目前得到快速发展和广泛应用。关于抗柑橘溃疡病的一些优质候选基因匮乏，且功能和作用机制研究不深，致使多基因协同对抗溃疡病还难以实现，制约了柑橘抗溃疡病分子育种的发展。挖掘更多与柑橘溃疡病紧密相关基因及其调控因子，深入解析其功能和机制，有利于抗溃疡病分子育种。

转录因子(Transcription factor，TF)，也称反式作用因子(Trans-actingelement)，是一类能够特异性结合真核生物启动子区域中顺式作用元件(Cis-actingelement)的蛋白质，其功能是调控基因的开启、关闭及表达量的高低。转录因子在调控柑橘生长发育、抗性和地理环境适应性等过程中发挥重要作用，但对转录因子之间及转录因子与其它关键调控因子间的相互关系还知之甚少。目前，研究转录因子调控及互作的传统方法主要有染色质免疫共沉淀，凝胶阻滞，双分子荧光互补技术等。这些方法可以用作转录因子与DNA互作和转录因子与蛋白的互作研究，但研究的转录因子数量有限，对参与多信号途径的复杂的转录因子调控网络的解析有很大局限。1989年出现的酵母双杂交系统可以用来研究蛋白与蛋白之间的互作(Fields and Song et al.，1989)，随后出现可以验证蛋白与DNA相互作用的酵母单杂交技术(Li and Herskowitz et al.，1993)，这使得解析复杂的转录调控网络成为可能。现在，酵母单双杂交cDNA文库已经得到广泛应用，但是由于cDNA文库中其它基因的数量远远高于转录因子，这一特征使得利用酵母单双杂交技术筛选和鉴定转录因子存在很大困难，而且假阳性率高，结果准确性大大降低(Mitsuda et al.，2010)。多数统计表明，转录因子只占所有基因很小的比例，拟南芥的转录因子的数量只占所有基因的5％(Riechmann et al.，2000)；水稻的转录因子占所有基因的2.6％(Xiong et al.，2005)；柑橘的转录因子占所有基因的4％。因此，亟待需要专用于转录因子筛选的酵母单双杂交文库，以提高转录因子的筛出效率和准确性。

拟南芥在2004年就进行了第一次转录因子文库的构建(Gong et al.，2004)，2009年拟南芥构建了昼夜节律调节转录因子文库，利用酵母单杂交技术解析了以基因CHE为中心的调节通路(Pruneda-Paz et al.，2009)。2014年在前人的工作基础上拟南芥再次建库并补充完善了部分转录因子，利用该文库筛选出了许多互作的转录因子(Pruneda-Paz etal.，2014)。目前，尚无柑橘溃疡病相关酵母文库筛选系统的报道。亟待构建一个溃疡病诱导的转录因子酵母文库，来对柑橘转录因子互作调控网络进行高效和精确解析，推动利用分子育种培育抗病柑橘新种质的进程。

发明内容

基于上述技术背景，本发明提供了解决上述问题的一种柑橘溃疡病诱导转录因子酵母文库、构建方法及其应用，筛选并克隆柑橘溃疡病诱导的转录因子并构建酵母文库，可用作柑橘溃疡病调控网络的高效构建，对研究柑橘溃疡病以及其他柑橘病害，具有重要的应用价值。

本发明通过下述技术方案实现：