[发明专利]基于野猪肾细胞的非洲猪瘟病毒抗体免疫荧光检测方法在审
| 申请号： | 202211137583.3 | 申请日： | 2022-09-19 |
| 公开（公告）号： | CN115896004A | 公开（公告）日： | 2023-04-04 |
| 发明（设计）人： | 赵东明;步志高;朱远茂;李芳;孙恩成;王婉 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心) |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071;C12N7/00;G01N33/569 |
| 代理公司： | 北京爱棱台知识产权代理事务所(普通合伙) 16054 | 代理人： | 张洪生;武志宏 |
| 地址： | 150069 黑龙*** | 国省代码： | 黑龙江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 野猪 细胞 非洲 猪瘟 病毒 抗体 免疫 荧光 检测 方法 | ||
1.一种野猪肾细胞，所述野猪肾细胞的微生物保藏号为CCTCC NO:C2022258。
2.一种野猪肾细胞的传代方法，所述传代方法为：在培养基中培养权利要求1所述的野猪肾细胞，得到传代的野猪肾细胞。
3.如权利要求2所述的传代方法，其特征在于，所述培养基为RPMI 1640培养液；
优选地，所述培养的条件为35-38℃，3-7％二氧化碳；
优选地，所述培养的时间为24-120h；
优选地，所述培养为单层培养；
优选地，所述传代的次数为1-50；
优选地，所述传代的次数为10-30。
4.提供了一种野猪肾细胞，所述野猪肾细胞是根据权利要求2或3所述的传代方法传代得到的所述野猪肾细胞。
5.一种非洲猪瘟病毒的培养方法，所述培养方法为：用权利要求1或4所述的野猪肾细胞作为培养细胞，培养所述非洲猪瘟病毒。
6.如权利要求5所述的培养方法，所述培养方法包括如下步骤：
S1：在培养基中培养所述培养细胞，得到增殖的培养细胞；
S2：将所述非洲猪瘟病毒接种到所述增殖的培养细胞，得到非洲猪瘟病毒培养体系；
S3：培养所述非洲猪瘟病毒培养体系，收获增殖的非洲猪瘟病毒；
优选地，在步骤S1中，所述培养时间为72-96h；
优选地，在步骤S2中，所述非洲猪瘟病毒接种剂量为0.05-0.5MOI，培养时间为72-144h；
优选地，在步骤S3中，所述培养的条件为35-38℃，3-7％二氧化碳。
7.一种试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1或4所述的野猪肾细胞；
优选地，所述试剂盒中还含有非洲猪瘟病毒和荧光分子标记的抗猪IgG抗体；
优选地，所述非洲猪瘟病毒为基因I型非洲猪瘟病毒；
优选地，所述荧光分子为FITC；
优选地，所述抗猪IgG抗体是兔抗猪IgG抗体；
优选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体；
优选地，述试剂盒中还含有非洲猪瘟病毒阳性血清、非洲猪瘟病毒阴性血清、细胞培养板、PBS溶液、4w/w％多聚甲醛固定液、0.25v/v％Triton-X100透膜液与RPMI 1640培养液中任一种或其组合。
8.权利要求1或4所述的野猪肾细胞，权利要求2或3所述的传代方法，权利要求5或6所述的培养方法，或权利要求7所述的试剂盒在如下A1到A9中任一方面中的用途：
A1：研究或制备非洲猪瘟预防制剂；
A2：研究或制备非洲猪瘟诊断制剂；
A3：研究或制备非洲猪瘟病毒检测制剂；
A4：研究非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测方法；
A5：研究非洲猪瘟病毒与抗非洲猪瘟病毒抗体相互作用机制的制剂；
A6：研究或制备非洲猪瘟治疗制剂；
A7：研究非洲猪瘟病毒遗传机制；
A8：研究非洲猪瘟病毒感染的病理机制；
A9：研究或制备干预非洲猪瘟病毒增殖的方法或药物的制剂。
9.一种抗非洲猪瘟病毒抗体检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
P1：用非洲猪瘟病毒感染权利要求1或4所述的野猪肾细胞，得到感染的野猪肾细胞；
P2：将所述感染的野猪肾细胞进行固定，得到固定化野猪肾细胞；
P3：将待测样本添加到所述固定化野猪肾细胞进行孵育，得到孵育的固定化野猪肾细胞；
P4：将荧光分子标记的抗猪IgG抗体添加到所述孵育的固定化野猪肾细胞进行孵育，得到标记的固定化野猪肾细胞；
P5：用荧光显微镜对所述标记的固定化野猪肾细胞进行拍照，根据拍照结果判定所述待测样本中是否存在抗非洲猪瘟病毒抗体。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，在步骤P1中，所述非洲猪瘟病毒的感染浓度为103.00TCID50/ml到105.00TCID50/ml，所述野猪肾细胞为单层细胞状态；
优选地，所述TCID50是根据Reed-Muench法计算得到的；
优选地，在步骤P1中，以RPMI 1640培养液为培养基，在35-38℃，3-7％二氧化碳条件下，感染时间为36-60h；
优选地，在步骤P2中，将所述感染的野猪肾细胞在固相表面进行固定；
优选地，在步骤P2中，所述固相表面为细胞培养板底面；
优选地，在步骤P2中，用4w/w％多聚甲醛固定液将所述感染的野猪肾细胞固定到所述固相表面；
优选地，在步骤P2中，固定时间为20-40min，在固定之前与之后分别用PBS清洗所述固相表面；
优选地，在步骤P2中，将所述固定化野猪肾细胞加入透膜液进行透膜处理后使用；
优选地，在步骤P2中，所述透膜处理的步骤为：使用0.25v/v％Triton-X100透膜液，室温透膜10-20min，再用PBS清洗所述固相表面；
优选地，在步骤P3中，所述待测样本为待测猪血清，稀释8-32倍后使用；
优选地，在步骤P3中，与所述待测样本平行设置非洲猪瘟病毒阳性血清测试对照和/或非洲猪瘟病毒阴性血清测试对照；
优选地，在步骤P3中，孵育温度为35-38℃，孵育时间为30-60min；
优选地，在步骤P3中，孵育后，用PBS清洗所述固相表面；
优选地，在步骤P4中，所述荧光分子为FITC；
优选地，在步骤P4中，所述抗猪IgG抗体是兔抗猪IgG抗体；
优选地，在步骤P4中，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体；
优选地，在步骤P4中，孵育温度为35-38℃，孵育时间为30-60min；
优选地，在步骤P4中，孵育后，用PBS清洗所述固相表面；
优选地，在步骤P5中，所述抗非洲猪瘟病毒抗体阳性判断标准为：可观察到特异性成簇的荧光灶；所述抗非洲猪瘟病毒抗体阴性判断标准为：观察不到特异性成簇的荧光灶。
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