[发明专利]基于野猪肾细胞的非洲猪瘟病毒抗体免疫荧光检测方法

说明书

本发明公开了一种野猪肾细胞，微生物保藏号为CCTCC NO:C2022258。本发明还公开了一种试剂盒，包含前述野猪肾细胞、非洲猪瘟病毒和FITC标记的抗猪IgG抗体，配合常规设备和试剂，应用该试剂盒能够良好地检测猪血清样本中是否含有抗非洲猪瘟病毒抗体。本发明还公开了一种抗非洲猪瘟病毒抗体检测方法，步骤为：用非洲猪瘟病毒感染前述野猪肾细胞，培养感染的细胞后进行固定，将待测血清样本添加到固定的细胞，孵育后再添加FITC标记的抗猪IgG抗体，然后用荧光显微镜拍照，根据拍照结果判定所述待测样本中是否存在抗非洲猪瘟病毒抗体。该方法敏感度高，特异性好，可推广应用。

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，涉及基于野猪肾细胞的非洲猪瘟病毒抗体免疫荧光检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染猪引起的一种急性、热性传染病。临床症状主要表现为高热、网状内皮系统出血。以直接、间接接触或软蜱吸血途径传播，仅感染猪科动物。强毒感染死亡率可达100％。世界动物卫生组织(WOAH)将ASF列为法定报告的动物疫病，我国动物疫病病原微生物名录将其列为一类动物疫病。根据编码p72蛋白基因B646L的3’端序列不同，将ASFV分为24个基因型。

2018年8月，ASF首次传入我国，在几个月内，疫情蔓延至绝大多数省(自治区、直辖市)。目前，ASFV在我国流行已经近4年，我国对ASF的防控仍无商品化疫苗可供使用，主要依靠生物安全防控策略，但是疫情的走向依然复杂且不容乐观。流行病毒学调查显示我国田间存在新的ASF流行毒株。致病性实验结果显示有些毒株仍具有很强的毒力，与我国首次分离鉴定的毒株Pig/HLJ/2018一样具有很高的致死力，有些毒株毒力明显降低。低毒力ASFV株感染后呈现亚急性或慢性病症、持续感染，不致死猪，但仍具有很强的传染性，导致流行隐蔽，不易察觉。WOAH推荐在ASFV低毒力流行地区或低流行率地区开展抗体监测。2021年7月中国动物疫病预防控制中心通过严格的比对筛选，公布了33个ASF抗体检测试剂盒(均为ELISA检测方法)作为应急使用，旨在通过常态化抗体筛查，早期发现ASFV感染猪，为ASF的防控提供重要指导。

WOAH和我国现行的非洲猪瘟诊断技术国家标准(GB/T 18648-2020)推荐的血清学检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光试验(IFA)。IFA是WOAH推荐的作为血清学检测方法确认的金标准，其他抗体检测方法尤其是ELISA方法均需要与之比较以确定其特异性和敏感性。然而，现用的IFA推荐的方法仍是Sánchez-Vizcaíno于1987年建立的，35年未进行明显的方法改进，主要受限于没有合适的细胞既满足ASFV良好的增殖，又适合进行IFA操作。目前用于ASF抗体检测IFA的细胞主要是非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和猴稳定细胞系(Monkey stable cells，MS细胞)，此细胞系虽可稳定增殖ASFV，但细胞病变多表现为单个细胞圆缩或几个细胞聚集，IFA时呈现点状绿色荧光，容易受因细胞衰老或其他致细胞损伤导致的非特异性荧光干扰，不易准确判断。

ASFV的天然宿主是猪，猴源细胞与猪源细胞的遗传差别，Vero细胞和MS细胞不能够充分模拟猪细胞中的病毒增殖等遗传活动。

尽管猪肺泡巨噬细胞(PAM)能够用于培养ASFV，但是PAM需要现用现制，难以在培养基中传代，成本高，也限制了使用的方便性。

如果能制备出来源于ASFV靶动物，可连续传代，易于培养，支持ASFV稳定增殖，低剂量接种ASFV后即可形成明显的细胞病变灶的细胞，则进行IFA检测时可能形成更明显的荧光灶，易于进行荧光观察和判定。其他细胞如Vero、MS细胞等进行IFA检测时，往往需要大剂量接种，形成的荧光多呈单个细胞点状，不易于进行荧光观察和准确判定。

发明内容