[发明专利]一种诱导细胞分泌细胞外基质的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种诱导细胞分泌细胞外基质的方法及其应用。所述方法包括如下步骤：(1)在基质胶包被细胞培养容器中使用TeSR1培养基培养细胞；(2)更换为含有CHIR99021的细胞培养基培养20～48h；(3)更换为含有维A酸和成纤维生长因子2的细胞培养基培养20～48h；(4)更换为含有激活素A和成纤维生长因子9的细胞培养基培养至少1d，即得细胞外基质。该方法能够高效诱导人源多能干细胞分泌细胞外基质，产量高，产率超过常规方法。且得到的细胞外基质相较于常规方法得到的细胞外基质的蛋白含量更高，且富含的蛋白及其他活性物质种类更丰富，具有更广泛的应用前景和更好的实用性。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，特别涉及一种诱导细胞分泌细胞外基质的方法及其应用。

背景技术

细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质，其可以构成复杂的网架结构，从而支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。细胞外基质主要由5类物质组成，包括胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖，按分布部位划分主要分为基底膜(Basement membrane)和间质基质(Interstitial matrix)。

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)，又称人诱导性多能干细胞，常简称为iPS细胞(iPSC)，是一种由哺乳动物成体细胞经转入转录因子等手段脱分化形成的多能干细胞。

目前，诱导细胞分泌ECM的方法相对单一，无法脱离诱导剂(如抗坏血酸)的使用，而且ECM的产出量和产出效率较低，难以满足工业化生产需求，还有现有技术获得的ECM品质普遍较差，蛋白含量，尤其是胶原蛋白含量较少，在利用EMC制备胶原蛋白等方面不具有可应用性。

发明内容

本发明旨在解决诱导细胞分泌EMC，其EMC产量少，蛋白含量低的技术问题。为此，本发明提出一种诱导细胞分泌细胞外基质的方法及其应用。本发明中的方法基于特定的诱导剂组合和诱导步骤，能够高效诱导人源干细胞分泌细胞外基质，其分泌量大，分泌效率高，且得到的ECM中富含大量的蛋白和其他活性物质，包括但不限于胶原蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖。

本发明的第一个方面，提供一种诱导干细胞分泌细胞外基质的方法，包括如下步骤：

(1)在基质胶包被细胞培养容器中使用TeSR1培养基培养细胞；

(2)更换为含有GSK-3α/β抑制剂的细胞培养基培养20～48h；

(3)更换为含有维A酸和成纤维生长因子2的细胞培养基培养20～48h；

(4)更换为含有激活素A和成纤维生长因子9和的细胞培养基培养至少1d，即得细胞外基质。

在本发明的一些实施方式中，所述干细胞包括人源干细胞。

在本发明中，术语“人源干细胞”是指人体干细胞，包括从人类骨髓、脂肪、脐带、胎盘中提取，通过体外提纯、增殖、培养等到的相关干细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述干细胞为人源多能干细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述干细胞为人多能干细胞(iPSC)或人胚胎干细胞(ESC)。

在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，所述GSK-3α/β抑制剂为CHIR99021，其在干细胞培养基中的终浓度为5～15μM。

在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中，所述维A酸在细胞培养基中的终浓度为1～10μM。

在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中，所述成纤维生长因子2在细胞培养基中的终浓度为50ng～200ng/mL。