[发明专利]敲除PRMT1基因的sgRNA及PRMT1基因敲除细胞系的构建方法和应用在审
| 申请号： | 202211143745.4 | 申请日： | 2022-09-20 |
| 公开（公告）号： | CN115725577A | 公开（公告）日： | 2023-03-03 |
| 发明（设计）人： | 吴欢生;胡西凤;邬向东 | 申请（专利权）人： | 江西农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/54;C12N15/85;C12N5/10 |
| 代理公司： | 南昌大牛知识产权代理事务所(普通合伙) 36135 | 代理人： | 刘俊文 |
| 地址： | 330046 江*** | 国省代码： | 江西;36 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | prmt1 基因 sgrna 细胞系 构建 方法 应用 | ||
1.一种敲除PRMT1基因的sgRNA，其特征在于，其核苷酸序列为：5'-GGGAATCGGGTCGGATCCAT-3'。
2.抑制PRMT1基因/蛋白表达的试剂在制备预防或治疗法氏囊病病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述试剂包括权利要求1所述的sgRNA和Cas9蛋白的mRNA序列。
3.一种基于CRSIPR技术构建PRMT1基因敲除细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据权利要求1所述的敲除PRMT1基因的sgRNA，设计两条反向互补核苷酸链，分别为：F：5'-CACCGGGGAATCGGGTCGGATCCAT-3'和R：5'-AAACATGGATCCGACCCGATTCCCC-3'；将上述两条反向互补核苷酸链酸链变性、退火形成双链；
(2)将步骤(1)得到的双链与酶切后的Cas9载体进行连接，得到重组敲除表达载体；
(3)将步骤(2)得到的重组表达载体使用转染试剂转染鸡成纤维细胞系DF-1细胞，经过继续培养、嘌呤霉素筛选及单克隆化筛选，得到PRMT1基因敲除细胞株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的Cas9载体为lentiCRISPRv2载体。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，DF-1细胞为处于对数生长期的细胞。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，嘌呤霉素筛选中的嘌呤霉素的浓度为2μg/mL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，嘌呤霉素筛选的操作具体为：转染24h后，用含2μg/mL的嘌呤霉素的10％FBS的MEM细胞培养液培养24h，然后更换为含2μg/mL的嘌呤霉素的10％FBS继续培养24h，然后再更换为含2μg/mL的嘌呤霉素的10％FBS继续培养24h，实现嘌呤霉素筛选。
8.一种PRMT1基因敲除DF-1细胞株，其特征在于，由权利要求3至7任一项所述的方法制备得到。
9.权利要求8所述的PRMT1基因敲除DF-1细胞株在调节干扰素水平中的应用。
10.权利要求8所述的PRMT1基因敲除DF-1细胞株在抑制法氏囊病病毒复制中的应用。
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