[发明专利]敲除PRMT1基因的sgRNA及PRMT1基因敲除细胞系的构建方法和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及敲除PRMT1基因的sgRNA及PRMT1基因敲除细胞系的构建方法和应用。本发明基于CRISPR/Cas9技术提供了一种靶向敲除PRMT1基因的sgDNA，该sgRNA能够特异性靶向PRMT1基因并结合CRISPR‑Cas9技术实现宿主细胞完全敲除PRMT1基因，获得稳定敲除PRMT1基因的DF‑1细胞株，该敲除细胞株干扰素诱导能力显著提高，而且能显著抑制IBDV的复制，为开展IBDV基础研究提供了有力工具，敲除PRMT1的鸡育种工作提供了科学依据。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及敲除PRMT1基因的sgRNA及PRMT1基因敲除细胞系的构建方法和应用。

背景技术

基因组操作技术是基于基因组和基因信息技术发展起来的通过人工设计实现对特定基因或基因组靶位点进行精确编辑的前沿技术，目前已经成为生物医学、农业动物育种和模式动物等领域的研究热点。通过人为操作引起基因组特定碱基插入、缺失或替换等，对基因组进行精确修饰和定向编辑的基因组编辑(Genome editing)技术的出现使得生命科学的各大领域有了新的进步，并且被广泛应用于基础研究和临床治疗等方面。早期开发的基因编辑技术对细胞活性的损伤较大，插入效率较低，因此，其应用较为受限。CRISPR-Cas9基因编辑技术为衍生的第三代新型基因编辑技术，由Cas9核酸酶和特异性的导向RNA(sgRNA)组合构成，该技术应用范围广泛，操作编辑，具有广阔的应用前景。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出的特有免疫系统～CRISPR系统。利用这个系统，细菌可以把病毒基因从自己的染色体上切除。CRISPR-Cas9最早来源于细菌/古细菌的一种获得性免疫防疫机制，经人工改造开发得到，是利用单链导向RNA(sgRNA)介导的一种特异性靶向基因组编辑技术。人为设计一种靶向特定基因组的sgRNA，转染进入细胞，sgRNA自由扩散进入细胞核，带有入核序列的Cas9核酸酶进入细胞核，Cas9定向结合sgRNA靶向的基因组PAM序列并进行高效切割，切割后的基因组发生断裂，并激发细胞固有的同源重组修复机制和非同源末端自我修复过程，实现对基因组特定位点的精确编辑和修饰。相比于第一代第二代基因编辑技术，CRISPR-Cas9基因编辑技术能大规模实现基因精准编辑，使用便捷，编辑效率高，操作简便，成本低廉，适用范围广泛，为基因组定向改造、调控与应用带来巨大应用前景，因此，该技术获得2021年诺贝尔化学奖，目前已深度应用在精准医疗，胚胎基因编辑等领域。

宿主精氨酸甲基转移酶1(Protein Arginine Methyl transferase 1,PRMT1)是蛋白质精氨酸甲基转移酶家族中的一个成员，该家族所有成员均可催化底物蛋白发生单甲基精氨酸修饰，并增加第二个甲基，产生一个不对称的二甲基精氨酸修饰，PRMT1属于I型PRMT，可催化底物蛋白发生不对称二甲基精氨酸修饰，目前认为，多数精氨酸甲基化修饰位点符合R GG，RG和RXR重复序列。目前以报道PRMT1发挥甲基酶活性调节众多底物，如组蛋白、PIAS1、hnRNPA1等，进而调节细胞信号通路的转导、转录调节和RNA代谢等。鸡源存在5个PRMT成员，PRMT1，PRMT3，PRMT4，PRMT5和PRMT7，不存在PRMT2，PRMT6，PRMT8和PRMT9。CRISPR-Cas9基因编辑虽然广泛应用于哺乳动物细胞和植物细胞，但是在低等生物，非哺乳动物细胞基因编辑应用仍未广泛开展，至今未构建出鸡源PRMT1基因敲除的DF-1细胞株。

传染性法氏囊病病毒(IBDV)为禽双RNA病毒科唯一成员，主要攻击3-5周龄的雏鸡，损害雏鸡的免疫中枢器官法氏囊，破坏雏鸡的免疫机能，导致雏鸡免疫功能低下，引起继发感染，大大提高雏鸡死亡率，俗称“鸡的艾滋病”，开展IBDV的基础研究对防控IBDV至关重要，因此，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建抑制IBDV复制的细胞株对研究IBDV特征意义重大。

发明内容