[发明专利]谷氨酸脱氢酶启动子突变体及其应用

说明书

本发明基于谷氨酸棒杆菌的gdh基因的野生型启动子，通过对其RBS区进行突变构建启动子文库，筛选获得具有增强活性的突变启动子，表现出比野生型更高的启动子活性。本发明的突变启动子可用于增强目的基因的表达，例如与gdh基因可操作地连接，可以增强谷氨酸脱氢酶的表达强度，由此提高了重组菌株的氨基酸例如谷氨酸生产效率，具有较高的应用价值。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体，包含启动子突变体的表达盒、重组载体、重组宿主细胞，以及增强目标基因表达的方法、制备蛋白的方法和生产氨基酸例如谷氨酸的方法。

背景技术

谷氨酸作为重要的氨基酸之一，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，被广泛应用于医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中，主要采用微生物发酵法来生产。目前，由于棒杆菌的生理优越性，棒杆菌已成为工业中最重要的谷氨酸生产菌株。随着生物技术的不断发展，对棒杆菌进行代谢工程改造提高其谷氨酸产量的报道逐渐增多，这些改造包括加强谷氨酸合成途径相关酶的表达，减弱竞争性途径相关酶的表达等等。

谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，由 gdh基因编码），可催化α-酮戊二酸生成谷氨酸，是谷氨酸生物合成的关键酶，同时由于谷氨酸是脯氨酸、赖氨酸等的合成前体或重要代谢物，已有文献报道，增强谷氨酸脱氢酶的表达可以提高菌株的谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸等的产量(WO0053726A1，JP61268185A，CN1262640C，Keleshyan, SK etal., Influence of Glutamate Dehydrogenase Activity on L-Proline Synthesis,APPLIED BIOCHEMISTRY AND MICROBIOLOGY, 2017,53(5):518-523)。本领域技术人员都知晓，增强酶的表达的方法有很多，如增加拷贝数、替换强启动子等等。由于增加拷贝数会在一定程度上增加菌株的负担，可能导致菌株的基因组不稳定，而启动子对基因的表达调控不存在以上缺陷。因此，对于提高棒杆菌氨基酸的生产效率来说，本领域需要开发丰富的启动子元件，以便适度增强 gdh等目标基因的表达，从而提高菌株氨基酸的生产效率。

发明内容

本发明基于谷氨酸棒杆菌的 gdh基因的野生型启动子，通过设计引物对该启动子序列进行定点突变，获得了活性增加的突变启动子，再针对其核心区及RBS区进行突变构建启动子文库，筛选获得具有增强的启动子活性的核酸分子，表现出比野生型更高的启动子活性，可用于增强目的基因的表达，因而完成本发明。

第一方面，本发明提供具有增强活性的谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体，特征在于，所述突变体的多核苷酸选自如下任一项：

（i）如SEQ ID NO：2所示的核苷酸；

（ii）包含与（i）所示的核苷酸序列的反向互补序列的多核苷酸；

（iii）包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与（i）或（ii）所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列的多核苷酸。

进一步地，所述突变体的核苷酸序列还包括在对应于SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第789至第799位存在突变的核苷酸。优选地，所述突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO：3-5所示。