[发明专利]一种羔羊皱胃活性成分的纯化及其应用

权利要求书

1.一种羔羊皱胃活性成分的纯化，其特征在于按下列步骤进行：

a、取新鲜羔羊第四胃，用自来水清洗胃腔内容物，剥除脂肪及结缔组织，于温度-80℃下冷冻3h，剪碎，冷冻干燥，液氮粉碎，即得羔羊第四胃粉末；

b、将步骤a所得羔羊第四胃粉末用磁力搅拌，石油醚脱脂3次，得到羔羊第四胃脱脂粉末，并于温度-20℃下冷冻保存；

c、将步骤b所得羔羊胃脱脂粉末以料液比24-36mL/ g，在温度20-45℃，pH值7.0，浓度50 mM的磷酸缓冲液中提取1.5-2.5h，其中磷酸缓冲液中含0.1-1mM的丝氨酸酶抑制剂、5mM乙二胺四乙酸和0.4-0.6 M的氯化钠；

d、将步骤c所得到的提取液在10000转/分下离心10分钟，得到提取液；

e、将步骤d得到的提取液用透析袋透析脱盐60 小时，冷冻干燥，得到羔羊皱胃提取物，称重计算提取率，于温度-20℃保存；

羔羊皱胃活性成分提取物的离子交换树脂分离纯化：

f、将步骤d中得到的提取液以含0.1-1mM的丝氨酸酶抑制剂和5mM乙二胺四乙酸的浓度50 mM的磷酸缓冲液，pH值为7.0为透析外液，用透析袋透析60h；

g、将步骤f中得到的透析后的提取物用步骤f的缓冲液稀释至800 mL，上样到pH值为7.0的含0.1-1mM的丝氨酸酶抑制剂、5mM乙二胺四乙酸的浓度50 mM的磷酸缓冲溶液预平衡的DEAE-52阴离子交换树脂，再依次用相同缓冲液及浓度0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M,0.5 M, 0.6 M, 0.8 M的NaCl溶液洗脱柱子，洗脱液在紫外280 nm测蛋白质洗脱曲线，用苯酚硫酸法在紫外490 nm处测定糖洗脱曲线；

h、将步骤g中浓度0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.8 M的NaCl洗脱部位分别用透析袋透析脱盐60 h后，分别冷冻干燥，称重，依次命名为F1, F2, F3, F4,F5, F6, F7, F8于温度- 20℃保存；

i、将步骤h中得到的F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8进行SDS-PAGE分析，分别进行考马斯亮蓝和PAS-考马斯染色法染色；

羔羊皱胃活性成分的凝胶柱分离纯化：

j、将步骤i中得到的F2部位在低温层析系统中以去离子水为洗脱剂，用Sephadex G-50分离纯化，流速为0.5 mL/min 洗脱液在280 nm处检测吸光度，每8min收一管，得到两个洗脱峰，分别命名为YGP-1和YGP-2的单一糖蛋白，再分别冷冻干燥，于温度-20℃保存；

k、将步骤i中得到的F8在低温层析系统中以去离子水为洗脱剂，用Sephadex G-50 分离纯化，流速为0.4 mL/min 洗脱液在280 nm处检测吸光度，每8 min收一管，得到两个洗脱峰，分别命名为YGP-3和YGP-4的单一糖蛋白，分别冷冻干燥，于温度-20℃保存。

2.根据权利要求1所述方法获得的羔羊皱胃活性糖蛋白YGP-1,YGP-2,YGP-3,YGP-4在制备抗炎活性药物中的用途。

3.根据权利要求1所述方法获得的羔羊皱胃活性糖蛋白YGP-1,YGP-2,YGP-3,YGP-4在制备抗炎活性保健品中的用途。

4.根据权利要求1所述方法获得的羔羊皱胃活性糖蛋白YGP-1,YGP-2,YGP-3,YGP-4在制备抑制HT-29人结肠癌中的药物中的用途。

5.根据权利要求1所述方法获得的 羔羊皱胃活性糖蛋白YGP-1,YGP-2,YGP-3,YGP-4在制备抑制HT-29人结肠癌中的保健品中得用途。