[发明专利]一种羔羊皱胃活性成分的纯化及其应用

说明书

本发明涉及一种羔羊皱胃活性成分的纯化及其应用，该方法取新鲜羔羊第四胃，经冷冻，剪碎，冷冻干燥，液氮粉碎，即得羔羊第四胃粉末，用磁力搅拌法石油醚脱脂得到羔羊第四胃脱脂粉末，在用含丝氨酸酶抑制剂和二乙胺四乙酸和NaCl的磷酸缓溶液搅拌，经离心，透析，冷冻干燥得到的提取物，再经阴离子交换树脂分离纯化，脱盐，凝胶柱分离纯化，冷冻干燥得到高纯度的化合物YGP‑1,YGP‑2,YGP‑3,YGP‑4糖蛋白。经抗炎活性结果显示：YGP‑2具有显著的LOX‑15酶抑制活性；YGP‑1,YGP‑2,YGP‑3,YGP‑4具有COX‑2酶抑制活性；对人结肠癌细胞HT‑29的抑制活性结果显示：YGP‑2，YGP‑3，YGP‑4具有抑制人结肠癌细胞HT‑29的活性；本发明所述方法步骤简易且成熟，操作简单不繁琐，所获得的羔羊皱胃活性成分可以用于医药和保健品领域。

技术领域

本发明涉及一种羔羊皱胃活性成分的纯化及其应用。

背景技术

糖蛋白(glycoprotein)是由寡糖链和多肽链共价链接而形成的复合大分子，广泛存在与动植物和微生物中。天然来源糖蛋白具调节免疫、抑制肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗疲劳、抗辐射等活性，有显著的药用功效和保健功能。目前，用于临床并具有高效免疫活性的药用蛋白制剂大多都是糖蛋白，其功能多样性也是目前糖生物学研究最活跃的领域。

羔羊皱胃是羔羊胃消化系统中唯一的具有化学和酶消化功能的胃，含有10余种分泌细胞，含有丰富的糖蛋白。羔羊皱胃不仅是药食兼用传统药材，而且现代临床药用历史可以追溯到上世纪的60年代。羔羊皱胃对治疗慢性胃炎和消化不良症药效突出，价格低廉，一直都是消化到疾病治疗和相关活性成分研究的热点。但所记载的现有关键技术只研究了其中凝乳酶和胃蛋白酶等消化酶，抗氧化活性多肽蛋白，益生菌活性糖蛋白等活性成分，并报道原料和总提取物具有治疗慢性胃炎和消化不良的药效。而基于其临床药效和现有技术没有关于其中抗炎和抗肿瘤相关化学成分的报道。既有必要研究羔羊皱胃中抗炎抗肿瘤活性成分并对其进行全面的结构表征，阐释其药效成分。

以糖蛋白作为关键词检索得到88篇从天然原料中获得糖蛋白的有关文件，其中提取方法和分离纯化方法14篇。

专利申请号202110922724.1以羔羊皱胃为原料提取了益生菌活性糖蛋白，申请号为202111360384.4是用天山马鹿的皱胃作为原料提取了透明质酸酶抑制活性糖蛋白，该两份申请都是本课题的前期研究，申请号202110922724.1用羔羊皱胃为原料获得益生菌活性糖蛋白，是在温度60℃高温条件下超声辅助提取法提取，乙醇沉淀和savage试剂脱蛋白后得到糖蛋白，得率为13.8％。申请号为202111360384.4是在室温条件下以氯化钠作为提取剂提取糖蛋白。

本发明是在本课题前期工作的基础上的进一步研究，两者的区别在于：本发明的提取方法在温度25-40℃，含0.1Mm-1mM的丝氨酸蛋白酶抑制剂和5mM二乙胺四乙酸和0.4-0.6的氯化钠pH的磷酸缓冲液中磁力搅拌提取，磷酸缓冲液可以保持提取液pH的稳定性，避免溶液pH骤变引起的蛋白质变性，丝氨酸算蛋白酶抑制剂和二乙胺四乙酸是常用的酶抑制剂和金属离螯合剂，可以避免溶液中的活性蛋白和糖蛋白等成分在提取过程中被降解或失活；温度25-40℃的提取是接近正常生理温度的温和条件有利于原料中的活性成分充分溶出和保留稳定的构型，合理的增大氯化钠的浓度可以增大原料中活性的提取率，因为蛋白质及衍生物在一定浓度范围内盐浓度越高溶解度越高，而大于合理范围后蛋白质和衍生物的溶解性反而降低，糖蛋白的亲水性相比于蛋白质高，因此较低的盐溶液中液可以有效提取糖蛋白；其次，本发明的羔羊皱胃糖蛋白活性成分并列产物，动物体内大部分糖蛋白以蛋白链为主要骨架完整糖蛋白中占比较高，而蛋白质在有机试剂中容易失去结构稳定性导致失活；本发明得到高纯度的糖蛋白只用了DEAE-52阴离子交换树脂和SaphadexG-50分离纯化两个步骤就得到了高纯度的糖蛋白，且所使用的仪器和填料相对于HPLC仪器和柱子陈本低，制备方法具有易放大，重复性高，产率高，成本低，无污染的特点。