[发明专利]一种室温条件下具有扩增活性的DNA聚合酶及其应用

说明书

本发明公开了一种室温条件下具有扩增活性的DNA聚合酶及其应用。DNA聚合酶即氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质IME199DNAP。蛋白质IME199DNAP可以在室温(20℃‑30℃)、pH值3.5‑9.5的条件下利用引物或无引物的情况下高效扩增单链DNA和双链DNA，同时该酶具有链置换活性，可用于等温扩增。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种室温条件下具有扩增活性的DNA聚合酶及其应用。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)技术问世以来，对整个生命科学的发展产生了深远影响，成为人们在体外获得目标基因的最常用的方法之一，已在各个领域得到了应用。但是，使用PCR技术扩增时，除了DNA聚合酶外，还必须配备大型且昂贵的热循环仪，这极大地限制了PCR技术在资源受限的环境中以及临时医疗检测分析中的应用。而与需要复杂的热循环仪介导变性、退火和延伸的PCR技术相比，等温扩增技术可以在室温或简单条件(例如水浴)下即可实现快速有效的扩增，其已成为一种有前途替代PCR技术的方法。

等温扩增技术是体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加恒温扩增酶和特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。目前已应用的恒温扩增酶(如Bst聚合酶、phi29聚合酶)不仅需要进口，而且价格昂贵，极大的限制了应用。因此，开发新的恒温扩增酶具有重要价值。

发明内容

本发明的目的为提供新的DNA聚合酶。

本发明首先保护蛋白质IME199DNAP，其为C1)-C4)中任一种：

C1)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

C2)在C1)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

C3)将C1)或C2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有DNA聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性、链置换活性和/或引物酶活性的蛋白质；

C4)与将C1)或C2)所示的蛋白质的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性且具有DNA聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性、链置换活性和/或引物酶活性的蛋白质。

其中，SEQ ID NO:2由779个氨基酸残基组成。

为了使C1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

上述C3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述C3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述C3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码上述任一所述蛋白质IME199DNAP的核酸分子。

所述编码上述任一所述蛋白质IME199DNAP的核酸分子可为如下e1)或e2)或e3)所示的DNA分子：

e1)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质IME199DNAP的DNA分子；