[发明专利]一种重组μ-芋螺毒肽及其制备方法

权利要求书

1.一种重组μ-芋螺毒肽，其特征在于，包括如下氨基酸序列：（Ⅰ）芋螺毒肽氨基酸序列；（Ⅱ）类固醇异构酶序列。

2.根据权利要求1所述的一种重组μ-芋螺毒肽，其特征在于，所述的（Ⅰ）μ-芋螺毒肽（μ-CTX）氨基酸序列如SEQ NO 1所示，所述的（Ⅱ）类固醇异构酶（KSI）氨基酸序列如SEQ NO 2所示，所述的μ-芋螺毒肽（μ-CTX）融合类固醇异构酶（KSI）以及纯化标签（6×His）、酶切位点（肠激酶酶切位点）的HIS-KSI-μ-CTX氨基酸序列如SEQ NO 3所示。

3.根据权利要求1所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：步骤一，菌株的构建与试表达；步骤二，菌株的发酵培养；步骤三，蛋白的分离纯化。

4.根据权利要求3所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，步骤一包括如下过程：

A1基因的设计与合成;A2载体的单酶切;A3基因片段与载体片段连接;A4连接产物转化至DH5α感受态细胞中;A5菌落鉴定;A6鉴定菌落的质粒提取;A7质粒转化至表达菌株感受态细胞中;A8表达菌株在试管中的小试培养;A9试管培养菌体的试表达验证;

步骤二包括如下过程：

B1发酵种子的培养;B2种子转接至发酵罐培养基中;B3培养至对数期进行IPTG诱导表达;B4继续培养4小时，离心收集菌体;

步骤三包括如下过程：

C 1菌体均质破碎;C2梯度离心法，收集包涵体，并进行包涵体洗涤;C3包涵体复溶，变性条件下NI柱亲和层析;C4纯化后的蛋白梯度去除变性剂，进行蛋白复性;C5复性后的蛋白进行肠激酶酶切，切除KSI融合标签;C6切除后的蛋白进行NI柱亲和层析进一步纯化，收集未结合NI柱部分即为μ-CTX蛋白;C7置换蛋白缓冲液。

5.根据权利要求4所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，A2中所述的载体为pET-28载体。

6.根据权利要求4所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，A7中所述的表达菌株感受态细胞为ER2566。

7.根据权利要求4所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，B4中所述的IPTG诱导浓度为1-2mM。

8.根据权利要求4所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，C4中所述的复性方法为梯度透析，其中使用buffer分别为50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，4M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，2M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，pH=8.0；25mM Tris，pH=8.0；或者为50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，4M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，0.5mM GSH，0.1mM GSSG，2M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mMNaCl，0.5mM GSH，0.1mM GSSG，pH=8.0；25mM Tris，pH=8.0。

9.根据权利要求4所述的一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，C5中肠激酶酶切条件为1U的肠激酶酶切50ug蛋白，于16度条件下酶切24小时或者为1U的肠激酶酶切50ug蛋白，于4度条件下酶切72小时。