[发明专利]一种重组μ-芋螺毒肽及其制备方法

说明书

一种重组μ‑芋螺毒肽及其制备方法，其中重组μ‑芋螺毒肽包括芋螺毒肽氨基酸序列和类固醇异构酶序列；芋螺毒肽制备步骤包括三步，分别是菌株的构建与试表达，菌株的发酵培养，蛋白的分离纯化。本发明中芋螺毒肽表达量可实现1.47g/L，提高了240倍；所制备的μ‑芋螺毒肽经细胞毒性测试显示毒性低于市售的芋螺毒肽，其细胞增值率提高20%左右；本发明制备的μ‑芋螺毒肽用作化妆品原料，可提高皮肤光亮度、淡化眼角皱纹、收缩毛孔，具有明显的功效活性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组μ-芋螺毒肽及其制备方法。

背景技术

芋螺毒素(conotoxin或conopeptide或CTX)，由海洋腹足纲软体动物芋螺(Conus)的毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，由许多单一毒肽组成的混合毒素，主要成分是一些对不同离子通道及神经受体高度专一性的活性多肽化合物。芋螺毒素多数由10-40个氨基酸残基组成，富含两对或三对二硫键，是发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的小肽，可作用于各种离子通道和受体的类型及亚型。与其他天然肽类毒素相比，芋螺毒素具有相对分子质量小、结构稳定、高活性、高选择性等突出优点。

根据芋螺毒素基因及其前体蛋白信号肽的保守性，可将芋螺毒素分为A、O、T、M、P、I等多个超家族。α、αA、κA属于A-超家族，ω、δ、κ、μO属于O-超家族，μ、ψ、ΚM属于M-超家族。天然的μ-芋螺毒肽是由22个氨基酸构成，分子中有三对二硫键，其连接方式为Cys13-Cys15、Cys4-Cys21、 Cys10-Cys22，其结构高度折叠，穿透力强，具有强效的抑制肌肉收缩的作用，因此具有迅速即时祛皱效果。

目前，制备芋螺毒素的方法主要有天然提取和人工化学合成。通过天然芋螺毒管中直接提取，这种方法获取的产量非常少，而且由于海洋生态的破坏使得野生芋螺数量急剧减少，使用该方法会进一步加剧芋螺资源恶化，因此采用天然分离提取获得芋螺毒素用于研究和工业化生产使用并不现实。人工化学合成的方法，即采用分离天然芋螺毒素后测序获得芋螺毒素序列，然后采用人工化学合成获得更多量的芋螺毒素。由于天然芋螺毒素含有特定的二硫键连接方式，因此如何合成特定二硫键连接方式的多肽成为合成中最大的难题，也成为限制获得大量天然芋螺毒素的关键因素。

随着生物技术的发展，采用基因工程的方法，将芋螺毒素的基因转化到微生物中使其表达，后期再进行分离纯化，可望生产出大量高性价比的重组芋螺毒素。但芋螺毒肽作为毒性蛋白，其在大肠杆菌表达的同时会影响宿主菌株的生长繁殖，使其表达产量降低，无法满足工业化生产。同时因芋螺毒素毒性较高，其安全性无法满足医药、化妆品领域的实际应用。如何生产出产量高且毒性低的芋螺毒素成为现阶段亟需解决的问题。

发明内容

本发明目的在于提供一种重组μ-芋螺毒肽及其制备方法，以解决重组μ-芋螺毒肽在大肠杆菌中表达产量低、活性低、毒性高的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明的一种重组μ-芋螺毒肽的制备及其应用的具体技术方案如下：

一种重组μ-芋螺毒肽，包括如下氨基酸序列：（Ⅰ）芋螺毒肽氨基酸序列；（Ⅱ）类固醇异构酶序列；

优选地，所述的（Ⅰ）μ-芋螺毒肽（μ-CTX）氨基酸序列如SEQ NO 1所示；

优选地，所述的（Ⅱ）类固醇异构酶（KSI）氨基酸序列如SEQ NO 2所示；

优选地，所述的μ-芋螺毒肽（μ-CTX）融合类固醇异构酶（KSI）以及纯化标签（6×His）、酶切位点（肠激酶酶切位点）的HIS-KSI-μ-CTX氨基酸序列如SEQ NO 3所示。

本发明的第二发明目的是提供一种重组μ-芋螺毒肽的制备方法，步骤如下：

步骤一，菌株的构建与试表达；

步骤二，菌株的发酵培养；

步骤三，蛋白的分离纯化。

其中，步骤一菌株的构建与试表达包括如下过程： A1基因的设计与合成，