[发明专利]一种作为内切β-1,3-葡聚糖酶的蛋白质、其制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种作为内切β‑1,3‑葡聚糖酶的蛋白质、其制备方法及其应用，所涉及的β‑1,3‑葡聚糖酶基因来源于拟杆菌属(Bacteroidessp.M27)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的DNA序列，所编码的β‑1,3‑葡聚糖酶是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质。利用该基因构建的重组大肠杆菌工程菌株能够高效表达制备重组β‑1,3‑葡聚糖酶。该酶以可得然多糖为底物，在pH6.0，40℃条件下比活力达到12.63U/mg，可以高效酶解可得然多糖制备得到聚合度(DP)3‑5的可溶性寡糖。上述重组β‑1,3‑葡聚糖酶还具有良好的抗真菌效果，可以抑制互隔链格孢菌等典型果蔬采后病原真菌的生长。本发明所公开的β‑1,3‑葡聚糖酶具有良好的酶学性质，在植物病原真菌的生物防治、功能低聚糖制备等领域具有良好应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域。本发明涉及了一种具有抗真菌作用的内切β-1,3-葡聚糖酶的制备方法，及其在生产低聚糖以及果蔬采后保鲜领域的作用。

背景技术

β-1,3-葡聚糖是一种在自然界中广泛存在的高分子多糖，主要分布于真菌、细菌和植物中。自然界中常见的β-1,3-葡聚糖包括昆布多糖、可得然多糖、酵母葡聚糖、地衣多糖以及香菇多糖等。β-1,3-葡聚糖降解所生成的低聚糖具有调节人类和动物的免疫反应，抗肿瘤，诱导植物产生抗病性等特性。因此，作为一种多功能的活性寡糖，β-1,3-葡寡糖被认为在农业、食品和医药领域具有很大的应用潜力。目前，β-1,3-葡寡糖主要是通过物理或化学方法降解可得然多糖或者其他β-1,3-葡聚糖获得的。相比于物理和化学方法，酶水解条件温和、过程可控、效率高。因此，酶水解在获得具有生物活性的寡糖方面受到了极大的关注。

β-1,3-葡聚糖酶是指能够切割β-1,3-糖苷键从而水解葡聚糖的一类酶系。根据其水解产物的不同可以划分为内切β-1,3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)和外切β-1,3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.58)。内切β-1,3-葡聚糖酶能够从β-1,3-葡聚糖糖链内部随机切断聚糖中的β-1,3-糖苷键，将聚糖水解生成一系列大小不同的低聚糖。外切β-1,3-葡聚糖酶则为从β-1,3-葡聚糖糖链的末端逐一切断β-1,3-糖苷键的一类酶，其水解产物为葡萄糖。内切的β-1,3-葡聚糖酶分布在GH16、17、55、64和81等家族，而外切-β-1,3-葡聚糖酶则属于GH3、5、17和55等家族。β-1,3-葡聚糖酶的应用范围较广，包括半纤维素废弃物的综合利用、啤酒和葡萄酒酿造过程中酒的过滤、饲料添加剂、活性多糖的改性增溶、以及真菌细胞壁结构分析等。由于β-1,3-葡聚糖是真菌细胞壁的组成成分，β-1,3-葡聚糖酶能够降解真菌细胞壁结构，从而致使菌丝体顶端膨胀、破碎、最终死亡。因此，β-1,3-葡聚糖酶也具有作为生防制剂的潜力应用于果蔬采后保鲜和植物病害防治中。有研究发现，来源于小麦的β-1,3-葡聚糖酶对多种病原真菌都有抑制作用，包括禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、链格孢菌(Alternariaalternata)、黑曲霉(Aspergillusnige)、青霉菌(Penicilliums.Sp.)等，其中对青霉菌的生防效果最好，抑制率可以达到25％左右。

果品蔬菜营养物质丰富，极易遭受植物病原菌的侵染。由致病真菌引起的果蔬腐败严重影响了果品蔬菜的品质，造成巨大经济损失。相比于传统化学杀菌剂，以酶制剂为代表的生物防治方法具有对环境无污染、专一性强、不产生耐药性等优点。随着消费者们食品安全意识的增强，探索新型无毒无害的生物防治方法是果蔬保鲜领域的发展趋势。目前的专利公开的β-1,3-葡聚糖酶主要来源纤维化纤维微细菌、粘细菌和绿色木霉(公开号：CN106755012B；CN109295031B；CN101724573A)。尽管β-1,3-葡聚糖酶在生产低聚糖和抑制水果采后致病真菌都具有一定的应用潜力，但是现有的β-1,3-葡聚糖酶普遍存在酶活力较低、使用成本较高、抑菌效果不佳等问题。

发明内容