[发明专利]一种检测人ApoE基因突变的引物探针组及试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测人ApoE基因突变的引物探针组及试剂盒，包括检测ApoE T388C引物对与探针以及检测ApoE C526T引物对与探针；所述检测ApoE T388C引物对与探针包括：388F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，388R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针388P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述检测ApoE C526T引物对与探针包括：526F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，526R的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，探针526P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。本发明设计多对引物、探针并进行测试，挑选最优引物、探针组合，检测限更低；此外，本发明提供的引物探针组合，不需要额外添加剂，如PCR稳定剂、增效剂等，试剂成分更简单，操作更简便，成本更低。

技术领域

本发明属于基因检测领域，涉及一种检测人ApoE基因突变的引物探针组及试剂盒。

背景技术

ApoE是人体载脂蛋白之一。载脂蛋白是脂蛋白颗粒成分，参与脂蛋白合成、分泌、加工和代谢，在血液脂质代谢中有重要作用。ApoE基因多态性在高血脂症、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病早期及发展过程中发挥重要作用。另外，有研究表明，ApoE基因是目前已知的阿尔茨海默病最密切的遗传标志物，其多态性与阿尔茨海默病的易感性显著相关。

对于ApoE的基因检测主要是位于112位氨基酸的碱基(C.388TC，Cys130Arg)和158位氨基酸的碱基(C.526CT，Arg176Cys)。依据112和158位氨基酸的不同组合，形成三种ApoE，即E2、E3和E4，在人群占比分别为8％，78％，14％，其中ApoE3是野生型基因，E3的112、158位氨基酸分别是半胱氨酸和精氨酸，Apo E2、E4分别是突变型，E2在112位和158氨基酸都是半胱氨酸，E4的112位和158位氨基酸都是精氨酸。根据2个SNP基因的不同，ApoE基因可以产生6种常见基因型，包括3种纯合型(E2/E2、E3/E3、E4/E4)和三种杂合型(E2/E3、E2/E4、E3/E4)。自然人群中，E3基因频率分布最高，在中国人群中，ApoE3/E3表型分布约占70％。

目前对于ApoE这两个位点的检测主要有直接测序法、基因芯片杂交法、PCR-Taqman MGB探针分型法、ARMS-PCR法和PCR-熔解曲线法。

直接测序法是SNP分型的“金标准”，但是操作复杂、周期长、通量低、成本高；

芯片杂交法操作复杂，需要经PCR后的产物与探针杂交，辨别颜色变化进行基因分型，需要开盖操作、容易污染；人眼识别，容易出错；实验周期也较长；

Taqman(MGB)探针分型通过对一个位点设以对特异性引物及两个探针(一个探针对应一种基因突变)，实现基因分型，是目前CFDA批准试剂盒主要的检测方法。但是该方法需要针对一个位点设计两个探针，成本较高，并且MGB探针有专利保护，使用受限。

ARMS-PCR，等位基因特异性扩增法，也称扩增阻碍突变系统，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行平行PCR，只有突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物，由于错配位于引物的3’端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。该方法通过采用PCR反应结束后进行电泳，从有无扩增条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的一起，但电泳操作，增加了PCR污染的结汇，而且耗时费力。