[发明专利]一种低酸性组分含量的重组抗EGFR单克隆抗体

说明书

本发明提供了一种低酸性组分含量的重组抗EGFR单克隆抗体，属于医药领域。所述重组抗EGFR单克隆抗体中，酸性组分的含量为6％以下，不仅有利于提高重组抗EGFR单克隆抗体的纯度，还有利于提高重组抗EGFR单克隆抗体的生物活性和安全性。本发明提供的重组抗EGFR单克隆抗体中酸性组分含量低，DNA的残留水平低，纯度高，生物活性高，安全性好，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种低酸性组分含量的重组抗EGFR单克隆抗体。

背景技术

单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)是由单一B细胞克隆产生的具有高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，具有特异靶向性，适应症主要集中在肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等方面。自1997年全球第一个治疗性单克隆抗体Rituxin由FDA批准上市以来，单克隆抗体迅速在全球的生物医药领域迅猛发展，成为近年来研究热点之一。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种跨膜糖蛋白，在实体瘤中呈现高表达。EGFR表达阳性的肿瘤具有恶性度高、侵袭力强的特点，且EGFR表达水平的高低与预后相关，因而成为当前肿瘤分子靶向治疗的一个重要靶点。以EGFR为靶标的单克隆抗体药物，能与内源性配体竞争结合EGFR，通过抑制酪氨酸激酶的激活、促进EGFR内化等作用产生抗肿瘤效应。

目前国内外已有3种抗EGFR单克隆抗体上市，与其他化疗药相比，具有靶点明确、疗效显著、毒副作用低等特点，在临床上取得了较好的疗效。微生物发酵是制备抗EGFR单克隆抗体的主要方法。最早上市的抗EGFR单克隆抗体是2004年被美国FDA批准的西妥昔单抗(Erbitux)，它是一种重组的抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体，用于治疗转移性结肠癌。但是，在发酵过程中除了会表达抗EGFR单克隆抗体外，还伴随有大量的杂质产生，包括宿主细胞蛋白质(HCP)、宿主细胞DNA和培养基成分等。HCP可在低的百万分率(parts per million)水平下引起免疫应答，是一种重要的污染物。研究发现，哺乳动物细胞对由剪切应力引起的破坏敏感，这会导致杂质(例如HCP)的释放，影响产品稳定性和纯度。

另外，蛋白具有许多翻译后修饰，如末端的改变、糖基化、脱酰氨基作用、异构化、氧化、分裂、聚合等。几乎所有的这些修饰都会引起蛋白表面电荷的改变，如改变电荷基团数目或引起构象改变，形成电荷异质体。由于电荷异质体会影响药物的疗效和/或导致副作用，故需将其控制在可接受范围内。电荷异质体通常可以通过基于电荷的纯化方法分离成酸性峰，主峰和碱性峰，其中酸性峰的来源可分为以下几个方面：N位糖基化、C末端赖氨酸不均一性、氨基酸氧化、天冬酰胺脱酰胺化及天冬氨酸异构化、共价加合物和N末端谷氨酰胺及谷氨酸环化等。研究发现，酸性异质体对抗体的药效具有更大的不利影响，尤其是对于互补决定区(CDR)的修饰，比如曲妥珠单抗的酸性电荷异质性与HER2的亲和力明显下降，抗增殖作用减弱。单克隆抗体在表达过程中，经过多种翻译修饰之后，也会导致电荷异质性，体现在等电点不同，产生一系列不同等电点的抗体。电荷异质性会影响单克隆抗体的稳定性及生物学活性，因此在生产抗EGFR单克隆抗体时，降低产物中酸性异质体的含量具有重要意义。

申请号为201910035469.1的中国专利申请公开了一种抗EGFR全人源化单克隆抗体的纯化工艺，具体为将vectibix抗体细胞培养液依次进行以下处理：两级深层过滤澄清、亲和层析、低pH孵育病毒灭活、阴离子交换层析、阳离子交换层析、浓缩透析。其阳离子交换层析步骤中，所用填料Poros XS，层析柱2.6×25.4cm，CV 135mL，对层析系统进行消毒和平衡后上样，流速250cm/h，DBC≤65mg/mL填料，保留时间≥5min，淋洗所用平衡液：50mM Na-Acetate,pH值5.0，淋洗后洗脱，洗脱平衡液：50mM Na-Acetate,140mM NaCl，pH值5.0，收集UV280：150-150mAU/mm。该纯化工艺的纯化收率≥70％，纯化后原液纯度≥95％。但是，该纯化工艺无法将酸性峰和主峰及碱性峰分开，无法有效除去产物中的酸性异质体，会影响抗EGFR全人源化单克隆抗体的安全性及生物学活性。