[发明专利]具有可差别切割的接头的标记的探针及其在解码DNA和RNA分子中的用途

说明书

本发明涉及用于通过下述检测RNA、DNA或蛋白质靶序列的方法a）将具有通式（I）的探针文库杂交至RNA、DNA或蛋白质靶序列P–(CL‑D)_x（I）其中P：具有至少10个核苷酸或氨基酸的探针CL：可切割接头D：荧光染料X：1‑5的整数其中所述文库包含具有不同核苷酸或氨基酸序列的探针P和可用不同方式切割的不同组的可切割接头CLb）去除未杂交的探针并通过第一图像经由荧光团D检测杂交的探针c）通过不同的方式从杂交的探针顺序切割每组化学接头CL；去除如此切割的荧光团D并通过第二图像经由它们的荧光团D检测剩余的杂交的探针d）通过比较第一和第二图像来检测去除的荧光团De）经由与去除的荧光团D有关的探针P的序列信息获得靶序列的部分序列信息f）重复步骤c）直到所有组的化学接头CL都被切割为止。

技术领域

本发明涉及通过杂交标记的DNA探针来解码DNA和RNA分子的新方法，所述探针通过可切割接头（CL）与荧光标记或标签缀合。本发明还涉及通过不同接头与标记缀合的DNA探针文库，所述接头可以在不同条件下且以可预测的方式被选择性切割掉。

背景技术

标记的探针在现代生物学和医学中有许多应用。例如，标记的DNA探针用于通过杂交来检测DNA或RNA的特定靶序列。它们是DNA微阵列技术、DNA或RNA分子的特定序列的原位检测（例如FISH）以及DNA连接测序（sequencing by ligation）的基础，仅举几例。同样，标记的抗体用于检测特定的抗原靶。

传统上，具有荧光报道单位的标记的DNA探针通过稳定的接头附着到探针。当使用这种标记的探针时，它们只能在去杂交（de-hybridizing）条件下去除，例如在更高温度、低盐、使用甲酰胺、高pH等。对于探测多种靶，所述方法需要多轮杂交和去杂交步骤。两个步骤都是相对慢的：取决于探针的复杂度和长度，一般每个步骤需要半小时到过夜反应。

进一步地，用于执行这些步骤的相对苛刻的条件对于核酸靶以及在其上固定靶DNA或RNA分子的基底例如组织、表面涂层等可以是破坏性的。因此，它们可以限制可以进行多少数目的杂交-去杂交步骤的重复循环。在所述情况下，通量取决于使用的染料数目，以及使用的杂交和去杂交步骤轮次数目。两者都可以是限制因素。同样的问题继续存在于检测其他生物分子例如抗体、细胞碳水化合物和肽中。

因此，本发明的目的是提供用于在最少的杂交和去杂交轮次重复的情况下解码靶DNA和RNA分子的快速且高通量的方法。

RNA杂交测序（SBS）技术的现有技术涉及使用具有不可切割的接头的标记的DNA探针和/或使用无差别地可切割的二硫化物接头。因此，当前的方法不允许通过顺序切割步骤逐步切割和模式生成用于增加的解码通量。这些方法仅依赖于去杂交或单步切割用于从靶去除荧光报道分子。因此，它们自然具有有限的通量和应用。这些方法由于归因于使用去杂交步骤的重复处理的组织降解可能与某些表面化学或基质不相容，例如当用于原位测序和空间转录物组学研究时。

例如，WO2015054050A1公开了用于探测多种靶的方法，其中探针被切割，但每个切割步骤以相同的方式进行。因此，切割步骤不用于区分不同的探针。

发明内容

发现当标记的探针文库包含探针和标记之间的不同可切割接头时，可以以可预测和可控的方式实现标记分子的顺序去除。

因此，本发明的目的是用于通过下述检测RNA、DNA或蛋白质靶序列的方法

a）将具有通式（I）的探针文库杂交至RNA、DNA或蛋白质靶序列

P–(CL-D)_x（I）

其中P：具有至少10个核苷酸或氨基酸的探针

CL：可切割接头

D：荧光染料

X：1-5的整数

其中所述文库包含具有不同核苷酸或氨基酸序列的探针P和可用不同方式切割的不同组的可切割接头CL