[发明专利]一种检测三羧酸循环中有机酸的方法

权利要求书

1.一种检测三羧酸循环中有机酸的方法，其特征在于，所述方法使用衍生剂对液体生物样本直接进行衍生化并使用液相色谱-质谱联用技术进行检测；所述衍生剂由苯甲醇和三甲基氯硅烷组成；

所述衍生化的步骤由下列步骤组成：S1：向所述的液体生物样本中直接加入内标溶液和苯甲醇，再加入三甲基氯硅烷，混匀；S2：控温一段时间进行衍生反应；

其中，步骤S1中生物液体样本、内标溶液、苯甲醇及三甲基氯硅烷的体积比为2：2：5：3；步骤S2中控制反应温度为60℃，衍生反应时间为75min；所述生物样本为来自人体的尿液样本；所述有三羧酸循环中有机酸由下列有机酸组成：顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标溶液中含有以下化合物：α-酮戊二酸-¹³C₅、琥珀酸-d₄、富马酸-¹³C₄、苹果酸-d₃、柠檬酸-d₄。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的条件包括：色谱柱为Phenomenex Kinetex C₁₈ Column，2.6μm，100A，3.0×50mm；柱温为40℃；进样量为2～5μL；

采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流速为0.6mL/min，流动相A为0.1％甲酸-2mM乙酸铵-水溶液；流动相B为乙腈；梯度洗脱程序包括：0至0.5min 40％流动相A和60％流动相B，0.5min至2.2min流动相A由40％至0％、流动相B由60％至100％；2.2min至3.2min 100％流动相B；3.2min至3.25min流动相B由100％至60％、流动相A由0％至40％；3.25min至4.00min 40％流动相A和60％流动相B。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的条件还包括：强洗溶液为甲醇；弱洗溶液为0.5％乙腈水溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的质谱条件包括：采用电喷雾电离源和正离子模式；喷雾电压：5500V；温度：350℃；雾化气：55psi；辅助加热气：55psi；气帘气：25psi；碰撞气：6psi；采用多反应监测扫描方式。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用多反应监测扫描方式对所述有机酸进行定量和定性检测；顺式乌头酸的定量离子对为445.2→271.2，定性离子对为445.2→265.2；α-酮戊二酸的定量离子对为344.1→147.1，定性离子对为344.1→101.1；琥珀酸的定量离子对为316.1→101.1，定性离子对为299.0→101.1；富马酸的定量离子对为314.0→181.1，定性离子对为314.0→91.1；苹果酸的定量离子对为332.1→89.0，定性离子对为315.1→135.1；柠檬酸的定量离子对为463.1→237.1，定性离子对为463.1→283.1；异柠檬酸的定量离子对463.1→283.1，定性离子对为463.1→237.1。

7.衍生剂在用于制备检测液体样本中三羧酸循环中有机酸方面的用途，其特征在于，所述衍生剂由苯甲醇和三甲基氯硅烷组成；所述有机酸由下列有机酸组成：顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸；所述的液体样本与苯甲醇、三甲基氯硅烷之间的体积比为2：5：3；当所述的液体样本为来自人体的尿液的时候，直接向尿液中加入所述衍生试剂进行衍生，所述的衍生条件为：衍生反应的温度为60℃～80℃，衍生反应时间不低于75min。