[发明专利]一种检测三羧酸循环中有机酸的方法

说明书

本发明公开了一种检测三羧酸循环中有机酸的方法，所述方法使用衍生剂对生物样本进行衍生化并使用液相色谱‑质谱联用技术进行检测；所示衍生剂包括苯甲醇和三甲基氯硅烷。通过该方法能同时、快速测定尿液、血清/血浆、头发、粪便、唾液、脑脊液、卵泡液或组织等多种生物样本中的参与三羧酸循环的7种有机酸。该方法的准确度和精密度高、稳定性好，对疾病诊断或风险预测生物标志物研发开发具有重要意义。

本发明主张在先中国申请，申请号：202210943760.0，申请日：2022年08月08日，的优先权，该在先申请作为本申请的一部分。

技术领域

本发明涉及代谢组学及仪器分析技术领域，尤其涉及代谢物的检测方法，具体的说是一种检测三羧酸循环中有机酸的方法。

背景技术

三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA Cycle）由德国科学家Hans Krebs于1973年正式提出，在动、植物和微生物细胞内普遍存在。TCA Cycle是营养物质代谢的核心途径，糖类、脂肪和蛋白质的碳链降解产物都进入TCA Cycle，最终被分解为二氧化碳。TCA Cycle主要包括柠檬酸生成、氧化脱羧、草酰乙酸再生等阶段，在此过程中形成了多种重要的中间产物，包括柠檬酸（Citrate）、乌头酸[(Z)-Aconitate]、异柠檬酸（Isocitrate）、α-酮戊二酸（2-Ketoglutarate）、琥珀酸（Succinate）、富马酸（Fumarate）和苹果酸（Malate）等。该过程不仅为生物分子的合成提供原料，同时还释放大量ATP，为各种生化反应供能，是物质和能量代谢的联系枢纽。

TCA Cycle具有重要的生理意义，其中间产物的定性定量分析是基础及应用代谢研究的核心工具。目前在临床上对TCA Cycle中多种有机酸进行评估可以间接反应是否存在能量代谢异常，尤其是在儿童成长期间。能量代谢异常是由于代谢路径不畅，摄入的食物无法被高效转化为能量，以致无法满足基本生命及生理的活动，从而引发一系列的行为、心理、生理、甚至疾病的问题。近期国内外多项研究表明TCA Cycle有机酸可作为代谢组学研究的重要生物标志物，如早期糖尿病肾病以及肿瘤等。因此开发一种能够精确定量分析TCACycle有机酸的检测方法是当务之急。

TCA Cycle有机酸包括单羧酸、二羧酸及三羧酸，常用气相色谱法、液相色谱法等方法检测。其中，气相色谱法衍生程序操作繁琐，仪器分析时间长，不适用于大批量样本分析；而液相色谱法虽然操作简便，但依然存在很多问题。有机酸的强极性使其难以在传统的反相柱上保留，且不同有机酸包含多个pKa值，分析物电荷状态的变化会导致峰型异常，同时存在同分异构体、杂质等难以分离的问题，为色谱分析带来挑战。目前，已有一些液相色谱方法成功应用于TCA Cycle有机酸的检测，但大多采用HILIC或离子对色谱法。HILIC方法稳健性较差，保留时间时常漂移，不利于质量控制管理，离子对色谱法使用的离子对试剂会污染设备，影响其他项目的检测，需要耗费大量时间清洗仪器。鉴于上述情形，急需开发一种通量更高、更稳健的检测方法。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种检测三羧酸循环中有机酸的方法，该方法可以同时定量检测三羧酸循环中的7种有机酸；方法的准确度和精确度高，检测时间短且耐用性好；同时，所述方法不需要使用不挥发性盐类，有效减少了盐对质谱系统的污染。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种检测三羧酸循环中有机酸的方法，所述方法使用衍生剂对生物样本进行衍生化并使用液相色谱-质谱联用技术进行检测；所述衍生剂包括苯甲醇和三甲基氯硅烷。

本发明使用苯甲醇和三甲基氯硅烷作衍生剂，对生物样本的有机酸进行检测，衍生效果更优。如在本发明的一些实施例中，使用苯甲醇和三甲基氯硅烷能同时衍生生物样本中的顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸这7种有机酸以使其被检测到；而使用丹磺酰肼衍生尿液样本未能达到理想的效果。