[发明专利]一种提高基因敲入效率的方法及其应用

权利要求书

1.一种提高基因敲入效率的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

利用细胞周期阻滞物将原代细胞周期同化后，将基因编辑组合物引入所述原代细胞中，然后置于含有小分子组合物的培养基中进行培养即可；所述细胞周期阻滞物为DNA复制抑制剂；所述基因编辑组合物包括RNA-引导的核酸内切酶、引导RNA和同源重组模板；所述小分子组合物包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂和/或非同源末端连接修复途径的抑制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原代细胞包括干细胞和原代T细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA复制抑制剂包括羟基脲、阿非迪霉素、丁酸钠和胸苷。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA-引导的核酸内切酶为Cas9；所述Cas9由Cas9 mRNA、Cas9蛋白或表达Cas9的质粒进行提供。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引导RNA包括成簇的规律间隔的短回文重复RNA和tracrRNA；所述引导RNA由以下任意一种方式生成：

直接合成sgRNA；

将商品化的crRNA和tracrRNA在体外退火形成gRNA；

sgRNA质粒。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同源重组模板为包含供体序列的供体DNA；所述供体DNA由单链DNA模版供体ssODN、AAV腺相关病毒模板供体或质粒模板供体提供。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述AAV腺相关病毒模板供体的AAV血清型为AAV6。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括丁酸钠、伏瑞斯特、曲古柳菌素、丙戊酸、恩替诺特、帕比司他、MGCD0103、PXD101、Depsipeptide、MC1568、Tubastatin AHCl和ITF235。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非同源末端连接修复途径的抑制剂包括NU7026、NU7441和M3814。

10.权利要求1-9任意一项所述的方法在提高人类细胞基因敲入效率中的应用。