[发明专利]一种提高基因敲入效率的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种提高基因敲入效率的方法及其应用，涉及基因编辑技术领域。本发明提供了一种提高基因敲入效率的方法，所述方法首先利用细胞周期阻滞物同步化细胞周期，再在特定的时间点进行基因编辑，使得CRISPR编辑元件在群体细胞大多数处于合适的细胞周期(S期)时发挥作用，可以取得更高的HDR编辑效率。而且，本发明采用的细胞周期阻滞物细胞毒性极小，改进的基因组编辑系统为从操纵人iPSC基因组到创建基因修饰的动物模型的应用提供安全高效的工具。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种提高基因敲入效率的方法及其应用。

背景技术

人胚胎干细胞(ESC)因其具有无限的自我更新能力可为再生医学提供充足的细胞来源，但存在伦理问题。患者特异性诱导的多能干细胞(iPSC)具有无限的自我更新和多向分化能力，同时也解决了与同种异体细胞的移植有关的免疫原性问题和伦理问题。基因编辑后的iPSC可为临床细胞治疗和再生医学提供充足的细胞来源。为了充分发挥iPSC在基础研究和再生医学中的应用潜能，通常需要对这些细胞进行基因修饰，例如矫正病患基因以进行替代治疗。然而在这些具有临床意义的细胞中，基因编辑效率特别是同源重组指导的修复(HDR)介导的精确基因敲入效率较低，已经成为iPSC在临床上广泛应用的瓶颈。因此，研究用于进行高效精确基因敲入的新方法是当前的一个重要课题。

CRISPR(成簇的规律间隔短回文重复序列)是原核生物基因组上的一段重复序列，其中最具代表性的CRISPR-Cas9(成簇的规律间隔短回文重复序列-CRISPR相关蛋白9)系统因其操作简便性现已广泛应用于基因组编辑中。CRISPR-Cas9是化脓性链球菌(Sp)中发现的一种免疫系统，可以靶向并切割外源DNA来防御病毒。在该系统中，在指导RNA(gRNA)的指导下，核酸内切酶SpCas9切割同源DNA的两条链。CRISPR-Cas9系统中的gRNA由两部分组成：与目标DNA互补的20个核苷酸序列的crisprRNA(crRNA)、以及反式激活crisprRNA(tracrRNA)。商品化的tracrRNA和crRNA经过化学修饰具备良好的电转稳定性，经过简单的退火过程就可在体外形成gRNA。工程改造的sgRNA(单指导RNA)已被广泛用于编辑所有类型的哺乳动物细胞。

将CRISPR-Cas9编辑元件递送到细胞中有多种方式，其中最常用的递送方式是将带有Cas9核酸酶和gRNA的DNA表达盒的质粒电转或以慢病毒载体感染的方式递送。但是已有多项证据表明这些方式会造成Cas9和gRNA的持续高表达，容易对编辑细胞的基因组进行反复切割从而加大了发生脱靶效应(off-target)的可能性。此外质粒载体的电转会激活iPSC中cGAS-cGAP等先天性免疫应答信号通路，造成严重的细胞毒性。这些问题限制了CRISPR-Cas9基因技术用于临床相关细胞的基因改造。现在通过用Cas9-gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物替代传统质粒或慢病毒载体，不仅提高编辑效率减少脱靶，并且可以避免质粒引起的细胞免疫反应。这些优点使得RNP递送编辑元件的方法成为编辑敏感人类干细胞和原代细胞基因组应用于临床治疗的首选。

RNP复合物中的gRNA与目的基因组DNA序列反向互补后，Cas9核酸酶构象发生改变产生DNA切割活性引起DNA双链断裂(DSB)。断裂的基因组双链DNA对细胞是一种极度危险的信号，细胞会立即募集相关蛋白、激活多种DNA修复机制促进DNA连接。最典型DSB修复方式主要包括：非同源末端连接(c-NHEJ/NHEJ)、替代末端连接或微同源介导的末端连接(alt-EJ/MMEJ)和同源重组指导修复(HDR)。NHEJ或MMEJ途径不需同源修复供体模版可以在多种蛋白的参与下直接链接断裂的DNA，但是在此过程中可能会在打靶位点引入可变插入或缺失(indels)，破坏基因的开放阅读框产生基因敲除(KO)。在存在与同源臂(HA)侧翼连接的供体模板时，细胞可以通过HDR途径在利用供体模版整合HA之间的序列，从而形成精确的期望目的片段敲入和整合。