[发明专利]一种云实皮提取物PK-PD模型建立方法及其应用

权利要求书

1.一种云实皮提取物PK-PD模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、标准曲线的制备

1)分别称取适量3-DSC、PTB、PTD，以甲醇溶解制成对照品储备液；

2)取适量葛根素溶于甲醇，稀释成IS溶液，对储备液进行梯度稀释分别获得3-DSC、PTB和PTD的标准曲线工作液；

3)将100μL标准曲线工作液和50μLIS溶液加入到100μL空白血浆中，制备3-DSC、PTB和PTD的标准曲线；

S2、云实皮提取物的制备

取云实皮干燥后用70％乙醇提取两次，将提取液混合过滤，减压蒸发乙醇，得到云实皮提取物；

S3、云实皮提取物治疗AA模型大鼠

1)取成年雄性SD大鼠，体重200-220g，饲养1周；

2)将上述大鼠随机平均分为CON组、MOD组、POS组和CDE组；除CON组外，其余组均于第1天右侧足底皮内注射CFA 0.1mL；POS组和CDE组分别口服给药雷公藤多苷片和步骤S2中的云实皮提取物；CON组和MOD组大鼠给予等体积的0.5％CMC-Na；按上述四组剂量给药，每日2次，连续给药14天；

3)末次给药后2h，经尾静脉收集各组大鼠血浆，采用ELISA法检测各组大鼠血浆TNF-α、IL-6、IL-1β和RF水平；麻醉后处死大鼠，切取右侧后踝关节，分离周围软组织，浸泡于4％多聚甲醛溶液中，进行组织病理学检测；取大鼠关节组织用EDTA-2Na脱钙，不同浓度乙醇逐级脱水，二甲苯透明包埋切片，厚度约4μm，脱蜡，以苏木精-伊红染色，于显微镜下观察各组大鼠关节的组织病理学变化；

S4、云实皮提取物在正常和疾病动物体内进行药动学实验

1)取若干只雄性SD大鼠随机分为3组：单次给药正常组、单次给药模型组、多次给药模型组；

2)多次给药模型组：灌胃给予步骤S2中的云实皮提取物，2次/d，连续给药14d；分别于给药前、末次给药后0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24h经尾静脉采血0.25mL，将血浆样品在4℃环境保存；

3)取上述血浆样品，6000-8000rpm离心10-15min后，取上清液分装成两份进行PK和PD分析，上清液样品储存在-80-90℃冰箱；

S5、PK样品前处理

取100μL步骤S4-2中的血浆样品、20μL步骤S1-2中的IS溶液和50μL 2％甲酸溶液加入1.5mL离心管中涡混1min，加入400μL的甲醇，涡混1-3min，超声10-13min，在4-8℃下12000-15000rpm离心10-12分钟；取上清液在37-40℃用氮气吹干，残留物溶解在150μL的50％甲醇中，在12000-15000rpm下离心10-12分钟，获得上清液，获得上清液注入UPLC-MS/MS系统进行分析；

S6、建立PK-PD模型

1)通过检测步骤S4-2中的多次给药模型组血浆样品中PTB、3-DSC、PTD水平及TNF-α、IL-6、IL-1β、RF水平，建立PK与PD的关系；

2)其中，采用Akaike‘s信息标准综合评价拟合优度；云实皮在AA模型大鼠体内的药动学曲线符合二室模型；通过比较不同的PK-PD模型，发现Sigmoid Imax模型对PK-PD数据的拟合效果最好，其公式如下：

2.根据权利要求2所述的一种云实皮提取物PK-PD模型建立方法，其特征在于，步骤S1-1中的储备液和步骤S1-1中的工作溶液均保存在4℃下，步骤S1-1中3-DSC、PTB、PTD的浓度分别为0.5021mg/mL、1.0040mg/mL、0.5021mg/mL。

3.根据权利要求2所述的一种云实皮提取物PK-PD模型建立方法，其特征在于，步骤S1-2中IS溶液的浓度为20ng/mL，3-DSC、PTB、PTD的标准曲线工作液浓度为0.20-50.21ng/mL、23.48-3006.00ng/mL和93.94-48096.00ng/mL。

4.根据权利要求2所述的一种云实皮提取物PK-PD模型建立方法，其特征在于，步骤S2中的云实皮的质量与70％乙醇的体积两次提取添加比分别为1:10、1:8，且提取时间分别为1.5h和1.0h。