[发明专利]酶突变体及其应用

权利要求书

1.D-氨基酸氧化酶的突变体，其特征在于，包括：

所述D-氨基酸氧化酶的第54位天冬酰胺被缬氨酸取代；和/或

所述D-氨基酸氧化酶的第56位半胱氨酸被天冬酰胺取代；和/或

所述D-氨基酸氧化酶的第58位苯丙氨酸被组氨酸取代；和/或

所述D-氨基酸氧化酶的第216位蛋氨酸被丝氨酸取代。

2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，还包括：

所述D-氨基酸氧化酶的第116位精氨酸被缬氨酸取代；和/或

所述D-氨基酸氧化酶的第319位赖氨酸被苏氨酸取代。

3.如权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，包括：

(a)、所述D-氨基酸氧化酶来源于鲑色锁掷酵母；和/或

(b)、所述D-氨基酸氧化酶具有特定氨基酸序列；和/或

(c)、所述D-氨基酸氧化酶的基因具有特定核苷酸序列；

所述特定氨基酸序列包括：

(I)、如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或

(II)、如(I)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(I)的相同或相似；或

(III)、与如(I)或(II)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；

所述多个为2个至110个；

所述特定核苷酸序列包括：

(IV)、如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

(V)、如(IV)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(IV)的相同或相似；或

(VI)、与如(IV)或(V)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述多个为2个至330个。

4.如权利要求1至3任一项所述的突变体，其特征在于，具有：

(1)、如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10、任一所示的氨基酸序列；或

(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或

(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；

所述多个为2个至110个。

5.编码如权利要求1至4任一项所述的突变体的核酸分子，其特征在于，具有：

(4)、如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9、任一所示的核苷酸序列；或

(5)、如(5)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(5)的相同或相似；或

(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述多个为2个至330个。

6.表达载体，其特征在于，包括如权利要求5所述的核酸分子，以及可接受的基因元件。

7.宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求5所述的核酸分子或包括如权利要求6所述的表达载体。

8.如权利要求1至4任一项所述的突变体、如权利要求5所述的核酸分子、如权利要求6所述的表达载体和/或如权利要求7所述的宿主细胞在如下方面中的应用：

(i)、提高D-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的转化率；和/或

(ii)、L-草铵膦的合成。

9.2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的合成方法，其特征在于，包括将草铵膦与如下任意项混合，反应，获得所述2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸：

(A)、如权利要求1至4任一项所述的突变体；和/或

(B)、如权利要求7所述的宿主细胞。

10.如权利要求9所述的合成方法，其特征在于，所述反应的温度为20～37℃；和/或

所述反应的时间为2～24h；和/或

所述反应在浓度为10～300mM的磷酸盐缓冲液中进行；和/或

所述磷酸盐缓冲液的pH为7.5～9.0；和/或

所述突变体的浓度为0.1～10g/L；和/或

所述突变体的酶活性为3.7～9.7U/mL；和/或

所述宿主细胞的湿重为100g/L。