[发明专利]酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及生物催化技术领域，特别涉及酶突变体及其应用。本发明提供了来源于鲑色锁掷酵母的D‑氨基酸氧化酶的突变体，突变位点包括N54V、C56N、F58H、M216S、R116V和/或K319T。该突变体具有高酶活、高转化率的特点，可高效制备2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，产物收率高。

技术领域

本发明涉及生物催化技术领域，特别涉及酶突变体及其应用。

背景技术

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一类含有黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化还原酶，能够催化D-氨基酸氧化脱氢，生成相应的α-酮酸、过氧化氢和氨。该类酶在自然界中分布广泛，主要来源于真核生物和少数原核生物。作为一种经典的生物催化剂，D-氨基酸氧化酶具有反应条件温和、底物谱广泛、对映体选择性好等特点，在合成医药、农药和精细化学品等方面具有重要的应用价值。

D-氨基酸氧化酶目前已经广泛应用于L-草铵膦(L-PPT)的制备，L-草铵膦是消旋体草铵膦发挥除草活性的主要活性物质，因此，L-草铵膦替代消旋体草铵膦，可以节约一半的草铵膦用量，从而降低农药的使用量，减少农民的除草成本。Green等利用RgDAAO和大肠杆菌来源转氨酶EcgabT进行去消旋化反应，将DL-草铵膦转化成了L-草铵膦，转化率达85％，ee值99％。薛亚平等利用RgDAAO和假单胞杆菌转氨酶进行去消旋化反应，将DL-草铵膦转化成了L-草铵膦，D-草铵膦(D-PPT)剩余0.8mM，转化率48.4％(其中，最大理论转化率为50％)，2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(PPO)的生成浓度为20mM。田振华等基于红酵母属来源的DAAO，利用定点突变技术，提高了DAAO酶活性、酶活稳定性提高和/或耐铵性增强。谢新开等利用基因突变和酶定向进化技术，对上述3个来源的DAAO进行了修饰，获得了具有更高的稳定性和/或对D-草铵膦具有更高活性的DAAO。杨立荣等利用粗糙脉孢菌NcDAAO和假单胞菌GluDH进行去消旋化反应，将DL-草铵膦转化成了L-草铵膦，20mM底物浓度条件下，D-草铵膦转化率99.4％，ee值＝99.1％。程峰等利用天冬氨酸氧化酶CeDAAO和谷氨酸脱氢酶突变体，将DL-草铵膦转化成了L-草铵膦，底物D,L-草铵膦转化率达到98.6％，产物ee值达99％。夏仕文等利用解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2全细胞中的D-氨基酸氧化酶催化D-草铵膦氧化脱氨为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(PPO)，L-草铵膦保留，反应总收率70％，光学纯度99％。

利用D-氨基酸氧化酶进行D,L-草铵膦拆分制备L-草铵膦已经成为了目前的研究热点。因此，提高PPO收率具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供酶突变体及其应用，具有高酶活、高转化率的特点，可高效制备2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，产物收率高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了D-氨基酸氧化酶的突变体，包括：

所述D-氨基酸氧化酶的第54位天冬酰胺被缬氨酸取代；和/或

所述D-氨基酸氧化酶的第56位半胱氨酸被天冬酰胺取代；和/或

所述D-氨基酸氧化酶的第58位苯丙氨酸被组氨酸取代；和/或

所述D-氨基酸氧化酶的第216位蛋氨酸被丝氨酸取代。

在本发明的一些具体实施方案中，上述突变体还包括：

所述D-氨基酸氧化酶的第116位精氨酸被缬氨酸取代；和/或

所述D-氨基酸氧化酶的第319位赖氨酸被苏氨酸取代。

在本发明的一些具体实施方案中，上述突变体包括：

(a)、所述D-氨基酸氧化酶来源于鲑色锁掷酵母；和/或

(b)、所述D-氨基酸氧化酶具有特定氨基酸序列；和/或