[发明专利]一种靶向活化型肝星状细胞的核酸适配体APT-Tan及其应用

说明书

本发明提供一种靶向活化型肝星状细胞的核酸适配体APT‑Tan及其应用，该适配体为单链DNA结构，所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO：1‑7所示的任一条DNA片段的核苷酸序列，所述核酸适配体能特异性进入活化肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）。本发明可用于肝纤维化的诊断，以及携带microRNA、siRNA等生物活性分子用作细胞内的药物运输载体。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体讲，涉及一种核酸适配体及其用途。

背景技术

核酸适配体是利用指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment technology，SELEX)，在体外经过多轮筛选获得的、能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸。核酸适配体具有特异性高、亲和性高、稳定性强、易化学合成和化学修饰等诸多优点。目前核酸适配体作为一类新型的、广受关注的检测和治疗工具，在人类医学研究、疾病诊断、病毒侵染机制研究等领域展现出广阔的应用前景。近20年，大量与肿瘤以及其他疾病相关的重要分子的适配体已被筛选出来应用于生物医学基础研究、疾病诊疗和药物研发之中。Pegaptanib(商品名Macugen)是第一个被美国FDA批准上市用于治疗老年性黄斑变性的适配体药物。还有Aptamera公司研制的核酸适配体药物AS1411，经临床试验研究表明，AS1411对乳腺癌、宫颈癌等肿瘤细胞有较强的抑制作用。这些都表明核酸适配体具有很好的临床应用前景。在传统基础上发展起来的Cell-SELEX技术，是将整个活细胞作为靶标来获取能与目的细胞相结合的适配体技术。该技术可以使细胞更接近自然状态，不仅可以获得未知目标信息的适配体，还可以区分细胞的某种状态，如分化或未分化细胞、正常细胞、癌细胞等。因此，该技术在肿瘤诊断、治疗和肿瘤标志物的发现方面具有巨大的应用潜力。

肝纤维化是以肝内结缔组织异常增生沉积为特征，是多种原因所致慢性肝病的共同病理改变。全球肝病的发病率正在增加，肝纤维化及其末期肝硬化在全世界构成巨大的卫生保健负担。2015年，全球约130万人死于慢性肝病(chronic liver disease，CLD)和肝硬化。CLD的病因包括慢性病毒性肝炎、酒精、非酒精性脂肪肝(non alcoholic fattyliver disease，NAFLD)、血色素沉着、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、胆汁淤积和自身免疫性疾病。不论病因为何，未经治疗的CLD的最终结果是炎症、肝实质丧失、纤维化和再生愈合。肝星状细胞(HSC)是定位于肝脏窦周隙的非实质细胞，也曾叫作Ito细胞，贮脂细胞和维生素A储存细胞。在正常肝脏中，HSC处于静止状态，其特点是能够在细胞浆内的脂滴中储存视黄醇酯，并具有血管周细胞的超微结构特征。在肝损伤愈合过程中，尽管其他细胞也做出重要贡献，但关键的纤维化效应细胞类型是活化的HSC。多病因导致的肝损伤，使静止的HSC被激活，失去储存的维生素A，从而转化为α-SMA表达阳性的肌成纤维细胞，进而分泌纤维胶原蛋白、弹性蛋白和基质蛋白，分泌促纤维化介质，导致肝纤维化。因此，采取切实可行的手段抑制HSC的活化被认为是阻止甚至逆转肝纤维化进程，达到预防、治疗肝硬化发生的关键。

发明内容

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子生物学、核酸化学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“生物分子”是指，存在于生物体中的分子的总称，包括但不限于，核酸、寡肽、多肽、纳米颗粒、糖类、脂质、和小分子化合物以及其任意的复合物。

术语“适配体”通常是指是一小段经体外筛选得到的能与蛋白质或代谢物等配体特异和高效结合的RNA或DNA片段。术语“肝纤维化”通常指的是一个病理生理过程，是指由各种致病因子所致肝内结缔组织的异常增生。