[发明专利]用于变体检测的方法

说明书

本发明可用来提供检测DNA中的变体诸如SNP和插入/缺失的更有效和不太易错的方法。本发明还提供了用于进行便宜的多重测定的方法。

本申请是申请号为2016800685006的中国专利申请(申请日：2016年11月25日，发明名称：用于变体检测的方法)的分案申请。

技术领域

本发明可用来提供一种检测DNA中的变体诸如单核苷酸多态性(SNP)、多核苷酸多肽性(MNP)和插入/缺失的更有效和不太易错的方法。本发明还提供了一种用于进行便宜的多色测定的方法，并且提供了用于在二维图中可视化多个等位基因结果的方法。

背景技术

RNA酶H2依赖的PCR(rhPCR)(参见美国专利申请公开号US 2009/0325169 A1，通过提及以其整体并入)和标准等位基因特异性PCR(ASPCR)均可用于突变检测。在ASPCR中，DNA聚合酶通过检测在引物的3’端或3’端附近的错配进行错配辨别。虽然ASPCR在错配检测中有时是成功的，但是由于野生型DNA聚合酶的低错配检测能力，辨别可能受限。

与ASPCR相反，rhPCR中的RNA酶H2酶的错配灵敏度允许灵敏地检测DNA突变和从反应中消除引物-二聚体人工生成物。然而，当试图用rhPCR检测DNA突变时，引物内部的错配的定位是重要的。错配的位置越接近可切割的RNA，可从RNA酶H2酶观察到辨别越多，并且所得rhPCR测定的辨别越大。鉴于最常见的野生型DNA聚合酶诸如Taq经常显示出低水平的错配检测，在RNA酶H2切割后不能仅依赖该聚合酶进行该辨别。结合标准rhPCR的每个循环所需要的重复询问，当利用这些聚合酶时，不希望将错配放置在除了与RNA恰好相反之外的任何位置。

发明内容

本公开提供了利用高辨别聚合酶(high discrimination polymerase)突变体或其它高错配辨别聚合酶的测定，以创造可利用位于RNA的5’的错配的新的测定设计。

本发明可用来提供一种检测DNA中的突变(诸如SNP和插入/缺失)的更有效和不太易错的方法。本发明还提供了一种用于进行便宜的多色测定的方法。

本发明的这些和其他优势以及另外的发明特征将从本文提供的本发明的描述中显而易见。

附图说明

图1为显示本发明中利用的两种引物设计的示意图。a)部分为封闭-可切割的引物，其被设计以使得当与模板杂交时感兴趣的SNP在RNA碱基的5’侧。RNA酶H2切割，留下3’询问碱基，通过高辨别力DNA聚合酶确定所述3’询问碱基为匹配或错配的。热循环允许该过程继续。b)部分示例说明RNA酶H2切割和SNP检测与a)相同，但是引物还包括5’“尾”结构域，其包括探针和通用正向引物的结合位点。在用RNA酶H2和该聚合酶辨别1-10个循环之后，高度浓缩的通用正向引物来主导扩增，当其扩增时降解探针。重复该循环25-50次，生成输出信号。该引物设计可为多重的，允许一管多色测定设计。

图2A和2B为来自实施例1描述的测定的终点荧光图。将FAM和HEX荧光值标绘在X和Y轴上。图2A为用野生型Taq聚合酶进行的rs351855的“通用”SNP测定。图2B为用突变体H784Q Taq聚合酶进行的rs351855的“通用”SNP测定，其证明了每个等位基因变体之间大大增强的辨别，如在突变体Taq的情况下由聚簇的更大分离所观察到的。在两种情况下，无模板对照(NTC)(正方形)在(0，0)坐标附近，如所希望的。等位基因1样品显示为圆形，等位基因2样品为菱形，并且杂合子为三角形。每个反应以一式三份进行。

图3A和3B为rs4655751的基因分型判定的等位基因辨别图。反应板在反应建立后即刻循环(A)或在循环前在台面上在室温保持48小时(B)。菱形：无模板对照(NTC)；正方形：等位基因1样品；圆形：等位基因2样品；三角形：杂合子。基因型是紧密群集在一起的并且具有良好的角度分离，这表示优异的等位基因特异性。将每个样品分配为正确的基因分型判定，并且48小时保持时期内观察到无性能变化。