[发明专利]一种适于数字PCR定量检测肺癌相关基因甲基化的引物探针组合、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种适于数字PCR定量检测肺癌相关基因甲基化的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括检测SHOX2基因、PTGER4基因以及RASSF1A基因甲基化的引物对和探针；所述引物对和所述探针适用于数字PCR；

用于检测SHOX2基因甲基化的引物对序列为序列表SEQ ID NO.1-2所示、序列表SEQ IDNO.3-4所示、序列表SEQ ID NO.5-6所示、序列表SEQ ID NO.7-8所示、序列表SEQ ID NO.9-10所示中的一对；用于检测SHOX2基因甲基化的探针序列为序列表SEQ ID NO.11-15中的一个；

用于检测PTGER4基因甲基化的引物对序列为序列表SEQ ID NO.16-17所示、序列表SEQID NO.18-19所示、序列表SEQ ID NO.20-21所示、序列表SEQ ID NO.22-23所示、序列表SEQID NO.24-25所示、序列表SEQ ID NO.26-27所示中的一对；用于检测PTGER4基因甲基化的探针序列为序列表SEQ ID NO.28-33中的一个；

用于检测RASSF1A基因甲基化的引物对序列为序列表SEQ ID NO.34-35所示、序列表SEQ ID NO.36-37所示、序列表SEQ ID NO.38-39所示、序列表SEQ ID NO.40-41所示、序列表SEQ ID NO.42-43所示、序列表SEQ ID NO.44-45所示、序列表SEQ ID NO.46-47所示、序列表SEQ ID NO.48-49所示中的一对；用于检测RASSF1A基因甲基化的探针序列为序列表SEQ ID NO.50-57中的一个。

2.一种适于数字PCR定量检测肺癌相关基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括血浆游离DNA提取试剂、亚硫酸转化试剂以及数字PCR反应混合液。

4.一种如权利要求2-3中任一项所述的试剂盒用于肺癌相关基因甲基化检测的方法，其特征在于，所述方法包括：

将采集的血液样本进行预处理，得到血浆样本；

提取血浆样本中的血浆游离DNA；

对提取的血浆游离DNA进行亚硫酸转化；

以亚硫酸转化后获取的DNA样本为扩增模板，进行数字PCR检测。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述将采集的血液样本进行预处理，包括：

采集的血液样本保存于离心管内，离心管内有抗凝剂；

对装有血液样本的离心管离心分离，移取上层血浆至新的离心管内。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述提取血浆样本中的血浆游离DNA，包括：

将裂解液、蛋白酶K、磁珠和血浆样本加入至离心管内混匀后，室温孵育；

将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附时除去离心管内液体；

向离心管内加入缓冲液混匀，以使磁珠均匀悬浮，然后将离心管内磁珠和液体转移至新的离心管内，并将新的离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附时除去离心管内液体；

向离心管内加入漂洗液混匀，以使磁珠均匀悬浮，然后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附时除去离心管内液体；带残留液体全部移除后，将离心管置于磁力架上，烘干；

向离心管内加入洗脱缓冲液混匀，以使磁珠均匀悬浮，孵育后，再将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附时，将离心管内液体转移至新的离心管内，得到血浆样本中的血浆游离DNA。