[发明专利]同时检测5种CTV基因型的多重RT-PCR引物组、试剂盒与应用

权利要求书

1.一种同时检测5种柑橘衰退病毒基因型的多重RT-PCR引物组，其特征在于，所述5种柑橘衰退病毒基因型为S1、VT、T3、RB、T36；所述多重RT-PCR引物组是由用于检测S1的引物、用于检测VT的引物、用于检测T3的引物、用于检测RB的引物和用于检测T36的引物组成；

S1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，S1下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

VT上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，VT下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示；

T3上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，T3下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示；

RB上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，S1下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示；

T36上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，T36下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示。

2.权利要求1所述的多重RT-PCR引物组在制备同时检测S1、VT、T3、RB、T36柑橘衰退病毒基因型的试剂中的应用。

3.一种同时检测S1、VT、T3、RB、T36柑橘衰退病毒基因型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的多重RT-PCR引物组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应体系、RT反应体系、阳性质控品和阴性质控品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RT反应体系包括解链液5μL、5×RT-buffer 4μL、30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.5μL、100U/μL的反转录酶RTase 1μL、无RNase超纯水4.5μL。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系包括无RNase超纯水12.1μL、10×PCR-buffer 4.5μL、2.5mM/L的dNTPs 2μL，10μmol/L权利要求1所述的多重RT-PCR引物组的上下游引物0.5μL、r-Taq酶0.4μL、反转录产物cDNA模板1μL。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述解链液由10μmol/L随机引物1.0μL、2.5mM/L dNTPs 1.0μL和RNA 3.0μL模板组成。

8.一种利用权利要求3所述试剂盒同时检测5种柑橘衰退病毒基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用所述多重RT-PCR引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物进行片段分析，得到待测样品是否受S1、VT、T3、RB和T36中的一种或多种CTV基因型侵染。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸50秒，35个循环。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述片段分析是对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定待测样品中是否受S1、VT、T3、RB和T36中的一种或多种CTV基因型侵染。