[发明专利]同时检测5种CTV基因型的多重RT-PCR引物组、试剂盒与应用

说明书

本发明提供了一种同时检测5种CTV基因型的多重RT‑PCR引物组、试剂盒与应用，属于植物病毒检测技术领域，所述5种柑橘衰退病毒基因型为S1、VT、T3、RB、T36；所述多重RT‑PCR引物组是由用于检测S1的引物、用于检测VT的引物、用于检测T3的引物、用于检测RB的引物和用于检测T36的引物组成。本发明设计的多对特异性引物和试剂盒，具有特异性强、灵敏度高的特点。本发明的试剂盒使CTV基因型检测过程更简便、更高效，大大节省了基因型检测周期，对完善CTV基因型的检测和防控有积极作用。

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，尤其涉及一种同时检测5种CTV基因型的多重RT-PCR引物组、试剂盒与应用。

背景技术

柑橘衰退病是由柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus，CTV)引起的对柑橘具有极大危害的一种经济性病害，其在世界各地广泛发生。CTV属于长线形病毒属(Closterovirus)，病毒粒子呈11×2000nm的长线形，基因组由约19300个核苷酸组成的正义单链RNA(+ssRNA)，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒。柑橘衰退病根据指示植物表现的表型可分为3种症状类型：茎陷点型、速衰型和苗黄型。CTV存在复杂的株系分化现象，目前已检测11种CTV基因型：VT、T30、T36、T3、A18、T68(B165)、RB、HA16-5、S1、L1、M1；另外，在野生柑橘种检测到一种新的CTV基因型：JY。并且，同一柑橘植株常常混合侵染多种CTV基因型，使得明确基因型与表型的关系变得困难。

目前，最常用的CTV基因型检测体系主要有三种。第一种是利用限制性内切酶HinfⅠ对CTV的外壳蛋白基因扩增产物在37℃下进行消化，根据消化后不同片段长度的图谱分为7个组群，结合CTV在指示植物上表现的不同生物学症状，将7个组群划分为潜在的弱毒株系和强毒株系；但该方法无法将7个RFLP组群与CTV基因型对应，且逐渐发现越来越多无法归类的组群出现，导致该方法的应用越来越少。第二种是通过比较CTV 5′端基因组5′URT、K17及POL区域的序列差异，设计了10对引物用于检测VT、T30、T3和T36基因型；该方法较为繁琐，且同样存在无法归类的CTV分离物。第三种Roy等设计的检测B165、VT、T30、T3和T36基因型的特异性检测引物，是目前较为常用的CTV基因型检测体系。另外，RB、HA16-5、S1、L1、M1基因型的发现者均设计了检测各自新基因型的特异性引物。由于CTV基因型众多、检测引物繁多、基因型检测体系多样，导致CTV基因型检测程序复杂、耗时，而且常常不同体系间的检测结果不一致，给CTV基因型检测和CTV致病机理研究带来困扰。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测5种CTV基因型的多重RT-PCR引物组、试剂盒与应用，本发明的引物组和试剂盒能够快速同时检测S1、VT、T3、RB、T365种柑橘衰退病毒基因型，不但能快速、准确的确定待测样品是否侵染柑橘衰退病毒，还能确定侵染柑橘衰退病毒基因型是S1、VT、T3、RB、T36中的一种还是多种，对完善CTV基因型的检测和防控有积极作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种同时检测5种柑橘衰退病毒基因型的多重RT-PCR引物组，所述5种柑橘衰退病毒基因型为S1、VT、T3、RB、T36；所述多重RT-PCR引物组是由用于检测S1的引物、用于检测VT的引物、用于检测T3的引物、用于检测RB的引物和用于检测T36的引物组成；

S1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，S1下游引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示；

VT上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，VT下游引物的核苷酸序列如SEQID No.4所示；

T3上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，T3下游引物的核苷酸序列如SEQID No.6所示；