[发明专利]一种载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法及应用

权利要求书

1.一种载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法，其特征在于，该法包括以下步骤：

a）将多糖溶解于氯化钠溶液或缓冲液中制备多糖溶液；

b）于步骤a）所得的所述多糖溶液中， 1-氰基-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸盐CDAP与多糖羟基反应制备活化多糖氰酸酯Cyanate；

c）于步骤a）所得的多糖溶液中，胱胺与步骤b）所得的活化多糖氰酸酯反应制备硫醇化多糖；

d）于步骤c）所得的硫醇化多糖溶液中，加入赖氨酸淬灭多糖游离氰酸酯；

e）用3（2-氯乙基）磷酸酯TCEP还原步骤d）所得的硫醇化多糖溶液中的硫醇化多糖二硫键形成含游离巯基的活化硫醇化thiolated多糖；

f）将载体蛋白溶解于所述磷酸盐缓冲液中制备载体蛋白溶液；

g）于步骤f）制得的载体蛋白溶液中，溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯BAANS与所述载体蛋白溶液中的蛋白氨基反应制备含有α-溴代乙酰胺基活化的载体蛋白；

h）将步骤e）所得的活化硫醇化多糖与步骤g）所得的含α-溴代乙酰胺基活化的载体蛋白反应，形成共价键多糖-蛋白结合物。

2.如权利要求1的一种载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法，其特征在于，所述的方法，还包括如下步骤：

i）淬灭步骤h）制备所述共价键多糖-蛋白结合物的结合反应液中，所述活化的载体蛋白中残留的α-溴代乙酰基及多糖中残留的巯基；

j）纯化所述多糖-载体蛋白结合物。

3.如权利要求2的一种载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法，其特征在于，所述步骤j）中的纯化为色谱凝胶过柱或超滤纯化。

4.如权利要求1所述载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法，其特征在于，所述步骤a）中的氯化钠溶液为0.85%的按质量百分比计的氯化钠溶液。

5.如权利要求1所述载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法，其特征在于，所述步骤a）中的缓冲液为磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液或碳酸钠缓冲液。

6.如权利要求1所述载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法，其特征在于，所述步骤c）中的所述胱胺为胱胺盐酸盐或胱胺二盐酸盐。

7.如权利要求1所述载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法，其特征在于，所述步骤h）中的所述多糖-蛋白结合物的多糖/蛋白的重量比w/w为0.45 -1.2。

8.如权利要求1所述载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法，其特征在于，所述步骤h）中的所述多糖-蛋白结合物的多糖-蛋白结合物的分子量为1500 kDa-24000kDa。

9.如权利要求1所述载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法，其特征在于，所述步骤a)的多糖为脑膜炎球菌荚膜多糖，流感嗜血杆菌荚膜多糖及肺炎链球菌荚膜多糖。

10.如权利要求9所述载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法，其特征在于，所述脑膜炎球菌荚膜多糖是血清型A、C、W135、Y或X荚膜多糖；所述流感嗜血杆菌荚膜多糖是流感嗜血杆菌b型荚膜多糖。

11.如权利要求9所述载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法，其特征在于，所述肺炎链球菌荚膜多糖来源于肺炎链球菌血清型Pn1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F荚膜多糖。

12.如权利要求11所述载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法，其特征在于，所述多糖是血清型1荚膜多糖、血清型3荚膜多糖、血清型6B荚膜多糖、血清型12F荚膜多糖、血清型17F荚膜多糖、血清型23F荚膜多糖或血清型33F荚膜多糖。