[发明专利]一种载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法及应用

说明书

本发明提供了一种多糖与载体蛋白共价键连接形成结合物的方法。该法以1‑氰基‑4‑二甲基铵吡啶四氟硼酸盐作活化剂，得到活化多糖氰酸酯。以胱胺为连接物，将胱胺一端的氨基与活化多糖上的氰酯基团反应，同多糖共价键连接，生成硫醇化多糖。以3（2‑氯乙基）磷酸酯还原硫醇化多糖中的胱胺二硫键，生成带游离巯基的硫醇化多糖。用赖氨酸猝灭未反应的氰酯。将反应产物透析，得纯化硫醇化多糖。现有的多糖蛋白结合疫苗中的荚膜多糖都可溶于氯化钠溶液或缓冲液中，相继通过CDAP活化和硫醇化后，与活化蛋白反应形成多糖蛋白结合物。含有游离巯基的硫醇化多糖溶液与溴乙酰化蛋白溶液混合后，再脱溴化氢，多糖与蛋白间以硫醚共价键连接，得稳定性好的结合物。

技术领域

本发明涉及一种结合物的制备方法，具体涉及一种蛋白与多糖通过共价键形成结合物的方法。其中荚膜多糖来源于流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌以及肺炎球菌。本发明还涉及使用上述新型多糖结合物接种动物，并检测获得的动物抗血清来评价结合物免疫原性。

背景技术

细菌多糖是非T细胞依赖性抗原，在儿童及成人中能够诱导短期免疫效应，但对婴幼儿无效。多糖能与主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)结合，MHC是抗原呈现和刺激T-Helper淋巴细胞必须组分。多糖在没有T-Helper淋巴细胞帮助下能够刺激B淋巴细胞产生抗体。非T-细胞依赖的B淋巴细胞的刺激结果导致这种抗原诱导的免疫效果缺乏记忆效应。

通过将多糖与载体蛋白共价键结合，可将非T-细胞依赖性抗原转变为T-细胞依赖性抗原。结合物中的多糖组分与B细胞结合后可活化T-Helper细胞，该T-Helper细胞是特异性识别结合物载体蛋白中的多肽部分。T-Helper细胞对载体蛋白响应可放大多糖抗体产量。从细菌多糖化学结构分析可见，需要对多糖进行活化化学修饰，才能够共价键连接至载体蛋白。

结合物中的载体蛋白提供了一定数量的T细胞抗原簇，这些T细胞抗原簇与CD4 T-Helper细胞作用，可极大增加针对于结合物中多糖的抗体数量。T-Helper细胞依赖对结合物响应，导致了婴幼儿血清IgG抗体增加和免疫记忆。另外，与原始多糖相反，多糖蛋白结合物免疫原性不取决于结合多糖的分子量；因此，用多糖或者小分子多糖制备的结合物有相似的免疫原性。

尽管多糖结合疫苗应用于临床已有多年，产品的有效期为二年，但产品在存放期间，合成的多糖蛋白结合物稳定性却差异大。

流感嗜血杆菌b型(Hib)多糖结合疫苗为采用该多糖蛋白结合技术最早开发出来的疫苗产品，应用于临床的疫苗产品采用的合成技术有两种，溴化氢活化多糖后加上ADH连接物，然后用己二酸二酰肼(EDC)将活化多糖上的ADH另一端连接至蛋白形成多糖蛋白结合物。另一种结合方法是将Hib多糖降解成短链多糖，采用还原胺法用多糖末端醛基链接至蛋白载体上形成多糖结合物。由于Hib多糖中含有磷酸二酯键，对碱性环境敏感，合成过程中容易降解；并且两种方法合成的结合物在储存过程中，特别是还原胺法合成的结合物的分子量会逐渐下降，进而导致结合物抗原性的下降。

流行性脑膜炎球菌，包括A、C、W135、Y、和X群，多糖结合疫苗也是采用多糖蛋白结合技术开发后期开发出来的后继临床使用产品，合成技术是采用溴化氢活化多糖后，加上ADH连接物，然后采用己二酸二酰肼(EDC)将活化多糖上的ADH另一端连接至蛋白形成多糖蛋白结合物。流脑A、C、W135、Y、及X群多糖结合物中，特别是C群和Y群，随储存时间延长，结合物中的游离多糖逐渐增加，这表明这两种结合物不稳定，易降解。