[发明专利]一种线性置换等温扩增方法及其应用

权利要求书

1.一种线性置换等温扩增方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)将外引物LOF、外引物LOR、内引物LIF、内引物LIR与靶序列杂交，在外引物和聚合酶的催化下形成单链DNA，在内引物作用下形成短双链DNA；

(2)短双链DNA发生动态解离，并在内引物和聚合酶的催化作用下进行扩增形成新的扩增产物；

(3)步骤(1)和(2)反复循环，得到大量的扩增产物。

2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，在步骤(1)中加入加速引物LAR；所述LAR位置处于LIF和LIR之间，且LAR与靶标结合的区域不与LIF和LIR与靶标结合的区域重合。

3.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述外引物LOF、外引物LOR、内引物LIF、内引物LIR、加速引物LAR的摩尔比为(1～2):(1～2):(4～10):(4～10):

(3～4)；优选地，所述扩增温度为60～66℃。

4.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述LIF的5’端到LIR的5’端长度为60-160bp；优选地，所述LOF的3’端到LIF的5’端长度为0-60bp。

5.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述靶序列的长度为100-200bp；优选地，所述靶序列的GC含量为35-70％。

6.根据权利要求1或2所述的扩增方法，其特征在于，所述引物序列为(A)～(C)中任一组：

(A)

外引物：

gE-LOF：ACGAGCCCCGCTTCCA；

gE-LOR：AGATGCAGGGCTCGTACA；

内引物：

gE-LIF：CGCGCTCGGCTTCCACT；

gE-LIR的序列为：

AGACCACGCGCGGCATCAG；或

GCGCGAGTCGCCCATGTC；或

AGCGTGGCGGTAAAGTTCT；或

CGTAGTACAGCAGGCACCG；

加速引物：

LAR：TGTCCCCGGGCGAGAAGA；

(B)

外引物：

LOF：CTGGATGATGATTGGTTCAG；

LOR：GAAGGGACGCTATGTCGA；

内引物：

LIF：TTATCAGATACCTATGCATACCCA；

LIR的序列为：

TGAACATGAGCTTTTCTTTATCGC；或

AACATCATCTTCCCGATA；或

TCCGGGTAATTTCTTCAACATC；

加速引物：

LAR：TACAAATAATCGCCCGTAGCTGAT；

(C)

外引物：

LOF：GGCCCTCGCATCCCTGA；

LOR：ACGCGGTCTCGAAGCA；

内引物：

LIF：TGGTGAACGTGTCCGAGGGC；

LIR的序列为：

CGGGCAGGAACGTCCAGATC。

7.一种引物组，其特征在于，包括权利要求1-6任一项中所述的引物。

8.一种检测产品，其特征在于，包括权利要求7所述的引物组；优选地，所述检测产品还包括荧光探针/荧光染料。

9.根据权利要求8所述的检测产品，其特征在于，所述荧光探针包括：OSD探针；优选地，所述OSD的制备方法为：将LAR引物进一步延伸并在5’端用荧光基团标记，并设计一个3’端用淬灭基团标记的互补引物形成OSD探针；

优选地，所述OSD探针的序列为：

gE-LAR-probe：ATCAGGTCGAACGTGTCCCCGGGCGAGAAGA；

gE-LAR-quencher：GGGGACACGTTCGACCTGAT。

10.权利要求7所述的引物组或权利要求8～9任一项所述的产品在病原微生物检测、物种鉴定、基因检测中的应用。