[发明专利]一种线性置换等温扩增方法及其应用

说明书

本发明公开了一种线性置换等温扩增方法及其应用。本发明的线性置换等温扩增(linear displacement isothermal amplification,LDIA)方法具体为针对模板的四种常用引物启动了LDIA的初始反应，包括一对外引物(LOF和LOR)和内引物(LIF和LIR)，还可以在反应中加入加速引物(LAR)，形成短序列产物。本申请的方法能在大幅度降低引物设计难度的同时，保持与其他等温扩增反应如环介导等温扩增方法等相近的敏感性和特异性。在现场检测，特别是应对复杂核酸序列时具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于等温扩增技术领域，具体涉及一种线性置换等温扩增方法及其应用。

背景技术

在生命科学领域中，核酸扩增技术是目前临床疾病诊断一种应用广泛的技术。聚合酶链式反应(PCR)是核酸扩增方法中最常见的一种，其引物设计相对简单，容易应用在不同的病原检测中。但由于其对反应温度和反应仪器的要求，难以应用到现场检测中。相比与PCR，等温扩增方法如环介导等温扩增(LAMP)、交叉引物扩增(CPA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等，因无需复杂的温度控制仪器，在现场检测应用中有着巨大优势。然而，严格的靶点要求和复杂的引物设计过程限制了其扩增范围。以LAMP为例，当面对长度小于200bp的片段或GC含量过高过低的片段时，其扩增效率会大大受限。除此之外，多对引物以及复杂的茎环结构可能会导致引物二聚体的形成从而产生非特异性扩增，造成假阳性。

因此，建立一种适用于检测不同长度和不同GC含量核酸片段的等温扩增方法并简化引物过程，具有重要的应用价值和研究意义。

发明内容

本发明的目的在于一种适用于检测不同长度和不同GC含量核酸片段、引物设计更加简单的等温扩增方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种线性置换等温扩增方法，具体包括以下步骤：

(1)将外引物LOF、外引物LOR、内引物LIF、内引物LIR与靶序列杂交，在外引物和聚合酶的催化下形成单链DNA，在内引物作用下形成短双链DNA；

(2)短双链DNA发生动态解离，并在内引物和聚合酶的催化作用下进行扩增形成新的扩增产物；

(3)步骤(1)和(2)反复循环，得到大量的扩增产物。

优选地，在步骤(1)中加入加速引物LAR；所述LAR位置处于LIF和LIR之间，且LAR与靶标结合的区域不与LIF和LIR与靶标结合的区域重合，其中加速引物LAR进一步与内引物LIF或内引物LIR扩增形成一个序列更短的扩增产物。

优选地，所述外引物LOF、外引物LOR、内引物LIF、内引物LIR的摩尔比为(1～2):(1～2):(4～10):(4～10):(3～4)。

优选地，所述扩增的条件为：60～66℃。

优选地，所述外引物、内引物的Tm值为50-70℃。

优选地，所述LIF的5’端到LIR的5’端长度为60-160bp。

优选地，所述LOF的3’端到LIF的5’端长度为0-60bp。

优选地，所述靶序列的长度为100～200bp。

优选地，所述靶序列地GC含量为35-70％。

在60℃-70℃之间，双链DNA处在解离和半解离的过程，因此可以在BST酶的作用下，使得双链无需完全被解开(95℃变性)的情况下即可让引物结合上，由此就无需传统PCR的变性、退火过程。

也正是因为没有变温过程，1：反应省去了升温、降温所需的时间；2：等温扩增处于一直反应的状态，而PCR只有当体系在72℃附近时才会启动延伸，因此本发明中的等温扩增反应效率更高。