[发明专利]一种萱草的遗传转化方法及其应用

说明书

本发明提供了一种萱草的遗传转化方法，包括如下步骤：使用农杆菌侵染液侵染萱草转化受体，农杆菌中包括目的基因和ANS的编码基因，农杆菌能够将目的基因和ANS的编码基因插入到萱草转化受体中并使所述目的基因和ANS的编码基因共表达。本申请首次利用三色堇ANS基因侵染萱草愈伤组织，证明了如SEQ ID No.1序列的三色堇ANS基因可以有效提高萱草愈伤组织遗传转化的成功率，通过荧光显微镜下检测，平均阳性率可以达到65％，实现萱草遗转化体系的构建；在萱草愈伤组织筛选培养过程中逐渐降低抗生素浓度，可以有效降低萱草愈伤组织的褐化率及白化率，更加优化了萱草遗传转化体系，进一步提高了萱草遗传转化的成功率。

技术领域

本申请涉及分子育种领域，尤其涉及一种萱草的遗传转化方法及其应用。

背景技术

萱草是百合科萱草属的多年生宿根草本，花型独特，花色繁多且易于栽培繁殖，既可以用于布置各式花坛、道路隔离带、疏林草坡，亦是很好的地被植物，具有很好的园林绿化效果。国内对萱草的研究主要集中在杂交及倍性育种、引种栽培和品种筛选评价等方面。国外对萱草的研究主要集中在抗性基因、倍性育种和遗传特性等方面。萱草的花色较为单一，因此花叶的观赏性研究也是进行品种选育需要着重考虑的因素。但是，传统的育种技术选育稀有花色或叶色品种的存在难度大、时间长的问题。因此，亟需建立一种高效可行的萱草遗传转化体系。

ANS基因是花色素重要的合成酶，是花青素合成下游途径中重要的调控基因，它可以催化无色的二氢黄酮醇形成砖红色的天竺葵色素、红色的矢车菊色素以及蓝紫色的飞燕草色素。很多品种的叶色观赏性不亚于花色，尤其是对于萱草这样花期较短的植物，可以拓展花色观赏价值，提高其商品价值。目前未有现有技术将ANS基因与萱草遗传转化进行联系。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效可行的萱草遗传转化体系，利用农杆菌将目的基因和三色堇ANS(VwANS)的编码基因插入到萱草转化受体中，并使目的基因和ANS的编码基因共表达，提高了萱草遗传转化效率。

一方面，本申请提供了一种萱草的遗传转化方法，包括如下步骤：

使用农杆菌侵染液侵染萱草转化受体，所述农杆菌中包括目的基因和ANS的编码基因，所述农杆菌能够将目的基因和ANS的编码基因插入到萱草转化受体中并使所述目的基因和ANS的编码基因共表达。

进一步的，所述ANS的编码基因来自三色堇、拟南芥、番木瓜、金钱橘、甜橙或苹果中；优选的，所述ANS的编码基因来自三色堇中；更优选的，所述ANS的编码基因包括SEQ IDNo.1所示序列和/或与SEQ ID No.1的序列具有至少90％以上序列同一性的序列。

本领域技术人员可根据常规技术手段设计获得ANS的编码基因的引物序列。

在一种优选的实施方式中，以三色堇为RNA模板，以SEQ ID No.2-3所示引物进行PCR扩增反应，获得如SEQ ID No.1所示ANS的编码基因。

VwANS-F(SEQ ID No.2)：GCTCTAGAGCCAGTTGGGCTGGGCTTAGAGVwANS-R(SEQ IDNo.3)：GCTCGAGCGGGACCATGTTGTGGAGGAT

进一步的，所述农杆菌为根癌农杆菌或发根农杆菌；优选的，所述农杆菌为根癌农杆菌；更优选的，所述根癌农杆菌选自EHA105、EHA101、LBA4404、GV3101、AGL1中的一种或多种；更优选的，所述根癌农杆菌为LBA4404。

进一步的，所述农杆菌中含有表达载体；优选的，所述表达载体选自PBI121、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA3300中的一种或多种；更优选的，所述表达载体为PBI121；

优选的，所述目的基因和ANS的编码基因位于表达载体上。