[发明专利]一种基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产及其应用方法

说明书

一种基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法及其应用，要点是利用AP‑MS和NGS测序联合的方式生产重组纳米抗体，并借助BLAST+和V‑QUEST软件的双重比对筛选高置信度的纳米抗体序列，利用多酶酶切的手段提高质谱检测纳米抗体的CDR区域覆盖率。可以准确高通量地识别出纳米抗体的CDR区和保守区，在功能验证时针对性和目的性更强。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产及其应用方法。

背景技术

目前鉴定和生产纳米抗体一般通过噬菌体展示技术来实现，具体流程如下：按照一定的时间间隔给骆驼科动物注射特定抗原以刺激其体内免疫反应的发生。从外周血淋巴细胞分离mRNA后，用PCR扩增VHHs(抗原结合功能区)并连接到克隆载体中。连接成功后的DNA材料随后转化大肠杆菌构建VHH文库。经过2至3轮的生物筛选后，用噬菌体ELISA法检测抗体与抗原的特异性结合。对ELISA阳性克隆的核酸序列进行测序，进而推断纳米抗体的蛋白序列。图中空心的红色菱形表示抗原。

但是通过噬菌体展示鉴定和生产纳米抗体的技术方案存在筛选阳性克隆效率低、噬菌体文库容量小的缺点。因为在现有方案中，选择最适合的阳性克隆是至关重要的，这一步通常使用体外检测(即ELISA)，通常需要两到三轮筛选才能得到预期的阳性噬菌体。但是，如果选择纳米抗体的特异性标准较高，获得阳性噬菌体所需的轮数可能会增加。并且在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在10以内。

为了研究血清中多克隆抗体的单克隆组成，我们采用了基于二代测序和蛋白质组学的方法。然而，这种方法很难实施，因为多克隆抗体具有高度的复杂性和缺乏在单个动物体内针对特定外来抗原产生的抗体序列参考数据库。为了应对这些挑战，我们利用亲和纯化来减少抗体样品的复杂性，并且利用二代测序来生成来自被免疫动物B细胞的参考数据库。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产及其应用方法。

本发明第一方面提供了基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法，在本发明创造的技术方案中，包括以下步骤：1)抗原制备和免疫动物；2)抗体的亲和纯化；3)免疫后骆驼B细胞总mRNA的提取以及纳米抗体参考蛋白库的制备；4)高亲和力纳米抗体的酶切以及蛋白质谱检测；5)纳米抗体参考蛋白库的搜库和高置信度纳米抗体cDNA的确定；6)高亲和力纳米抗体的基因工程表达。

在本发明一个优选的实施例中，验证后的纯化抗体用多种蛋白酶消化制备肽段，用LC-MS/MS进行高质量分析。

在本发明一个优选的实施例中，为了利用BLAST+和V-QUEST的方法鉴定抗体片段对应的肽段序列，我们通过对免疫动物B细胞总mRNA进行二代测序(NGS)，建立了抗原免疫产生的纳米抗体序列的参考数据库。

在本发明一个优选的实施例中，使用ProteinPlot软件识别与从血清中纯化的抗体相对应的高置信度的肽段序列。

在本发明一个优选的实施例中，经过BLAST+和V-QUEST软件的双重比对之后，得到高置信度的纳米抗体序列。

在本发明一个优选的实施例中，筛选出表达丰度较高和比对匹配率较高的纳米抗体序列，并对其进行基因工程表达和功能验证。

本发明的第二方面提供了基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法在抗体制备过程中的应用。

本发明的提供的技术方案与现有技术相比，具有以下的优点：