[发明专利]一种间充质干细胞复合冻存液及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种间充质干细胞复合冻存液及其制备方法和应用，属于干细胞培养技术领域，所述间充质干细胞复合冻存液中去铁胺终浓度为50‑500µM，曲恩汀终浓度为1‑20µM。本发明提供的复合冻存液相比常规的无DMSO、无血清的基础冻存液可更高效地维持人间充质干细胞长时间冻存和复苏后的细胞活率、贴壁率、增殖、干性以及分化能力，具有较高的临床研究和治疗应用价值。

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种间充质干细胞复合冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）是一类具有自我更新以及多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪以及多种组织器官的间质中。基于其在免疫调节，病原体清除以及组织器官结构功能修复等方面的重要生物学特性，间充质干细胞已被广泛应用于多种急性以及慢性疾病治疗的研究中，是再生医学技术的核心。

目前，已上市的干细胞类型产品均以细胞注射制剂形式进行规模化生产，以保障干细胞产品批次之间的稳定性。干细胞制剂通常采用超低温冻存的方式进行长期保存和运输。然而，研究发现低温冻存及复苏过程中冰晶引发的细胞机械损伤、氧化自由基以及细胞通透性的变化对干细胞的细胞活率以及免疫调节等生物学性能都有较大的影响。因此，研发出高效保持干细胞冻存及复苏后细胞活性和生物学性能的干细胞冻存保护液是干细胞产业化应用的重要前提。

传统的细胞冻存液主要是由二甲亚砜（DMSO）、胎牛血清和细胞培养基配置而成。血清是细胞生长不可或缺的成分，但动物血清作为异种血清不仅成分复杂，含有大量的氨基酸、核苷、蛋白质、激素、脂类等微量成分，并且上述成分的含量和具体作用仍没有完全确定，加之胎牛血清的来源为不同个体的胎牛，必然导致批间差异大。目前，有使用人血清、血小板裂解液或脐带血清替代胎牛血清的，但无论是动物来源的还是人类来源的血液，其成分都是未知的，且批次之间不可避免地会有差异。

由于动物源血清中存在成分不明的异种免疫源，且DMSO存在细胞毒性，在干细胞临床应用过程中会存在潜在安全性风险。因此，过去几十年大量国内外的研究聚焦于开发无DMSO、无血清的干细胞冻存液。

专利文献202111454669.4公开了一种干细胞冻存液，成分包括体积分数为20-40％基础培养基、10-20％甘油、30-60％人血白蛋白、2-6％海藻糖、0.5-2％甘氨酸或牛磺酸及6-10.5％肌醇半乳糖苷或糖苷类。所述干细胞冻存液中的肌醇半乳糖苷或糖苷类作为稳定剂，具有保护细胞表型的作用，从而提高干细胞在冻存条件下的活性。但肌醇半乳糖苷或糖苷类均是大分子物质，对干细胞微环境影响较大，并且大分子物质空间结构是否对干细胞的生长具有不良影响也没有经过验证。

据公开的国内外专利及研究资料显示，目前无DMSO、无血清的细胞冻存液主要成分包含冷冻保护剂、抗氧化物质以及维持细胞渗透压的溶剂。常用的替代DMSO的冷冻保护剂包括渗透性的甘油、乙二醇、乙酰胺等，以及非渗透性的聚维酮K30、羟乙基淀粉以及海藻糖等。抗氧化物质包括谷胱甘肽、L-肌肽、硫辛酸以及维生素C等。等渗溶剂通常采用葡萄糖氯化钠注射液、复方氨基酸溶液以及复方电解质等。

现有市售或自制的无DMSO、无血清的细胞冻存液仍无法有效抑制干细胞冻存复苏后细胞活率以及生物学功能的降低，进而对干细胞临床应用的有效性产生潜在的不良影响。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种间充质干细胞复合冻存液及其制备方法和用途，发明人发现适宜浓度的去铁胺和曲恩汀能有效提高冻存复苏后间充质干细胞的细胞活率和生物学功能。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供一种间充质干细胞复合冻存液，所述复合冻存液中包括基础冻存液、终浓度为50-500 µM的去铁胺和/或终浓度为1-20 µM的曲恩汀。