[发明专利]一种模块化组装双组分纳米颗粒制备方法及其应用

权利要求书

1.基于PCV2 VLP的二联疫苗的制备方法，其特征在于：将SpyCatcher基因融合到PCV2Cap蛋白的C端构建Cap-SC VLP，同时表达携带SpyTag的CSFV E2蛋白；

基于SpyTag和SpyCatcher之间的异肽键形成，ST-GFP和E2-ST在体外与Cap-SC VLP表面暴露的SpyCatcher结合，从而实现ST-GFP和E2-ST全长蛋白在PCV2 VLP的表面展示；所述目的基因Cap-SC、E2-ST的编码序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的基于PCV2 VLP的二联疫苗的制备方法，其特征在于：

目的基因Cap-SC的抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

目的基因E2-ST的抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)pET28a-Cap-SC原核表达载体构建和蛋白表达；

(2)HTA-E2-ST的构建和蛋白表达；

(3)纯化的E2-ST在体外与Cap-SC VLPs偶联以构建双组分Cap-GFP纳米颗粒。

4.根据权利要求3所述的猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于：

(1)pET28a-Cap-SC原核表达载体构建和蛋白表达：

Cap-SpyCatcher构建包括N端6×His标签、PCV2 Cap、柔性linker和截短的SpyCatcher，针对大肠杆菌密码子偏好性进行优化后，采用基因合成的方式合成；然后通过体外同源重组的方法将编码Cap-SC的DNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中，构建pET28a-Cap-SC；重组质粒pET28a-Cap-SC转化到大肠杆菌Transetta，诱导蛋白表达，并纯化获得Cap-SC融合蛋白；

(2)HTA-E2-ST的构建和蛋白表达：

SP-E2-Spytag构建包括N端分泌信号肽SP23、CSFV E2ZJ蛋白、SpyTag和6xHis标签，通过融合PCR合成；然后通过体外同源重组的方法将编码E2-ST的DNA序列克隆到杆状病毒表达载体pFastBac HTA构建HTA-E2-ST；HTA-E2-ST转化DH10Bac，随后按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书，经Tn7转座、蓝白斑筛选、杆粒提取和转染获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染足量的昆虫细胞，纯化获得E2-ST融合蛋白；

(3)纯化的E2-ST在体外与Cap-SC VLPs偶联以构建双组分Cap-GFP纳米颗粒：

Cap-SC VLPs与E2-ST以1:4的摩尔比混合，获得双组分纳米颗粒Cap-E2 NPs。

5.CSFV-PCV2二联颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：利用双组分纳米颗粒Cap-E2NPs，将Cap-E2 NPs与Seppic 206水佐剂充分混合、乳化，制得纳米颗粒疫苗。

6.如权利要求4所述方法制备获得的双组分纳米颗粒Cap-E2 NPs疫苗在制备防治猪瘟病毒感染药物中的应用。