[发明专利]一种模块化组装双组分纳米颗粒制备方法及其应用

说明书

本发明属于分子生物学及生物医学技术领域，涉及嵌合猪圆环病毒样颗粒的制备，以及双组分纳米颗粒在疫苗领域的应用。本发明公开了基于PCV2VLP的二联疫苗的制备方法：将SpyCatcher基因融合到PCV2Cap蛋白的C端构建Cap‑SC VLP，同时表达携带SpyTag的CSFV E2蛋白；基于SpyTag和SpyCatcher之间的异肽键形成，ST‑GFP和E2‑ST在体外与Cap‑SC VLP表面暴露的SpyCatcher结合，从而实现ST‑GFP和E2‑ST全长蛋白在PCV2VLP的表面展示。本发明的CSFV‑PCV2二联颗粒疫苗Cap‑E2NPs在细胞免疫方面表现出明显的性能提升。

技术领域

本发明属于分子生物学及生物医学技术领域，涉及嵌合猪圆环病毒样颗粒的制备，以及双组分纳米颗粒在疫苗领域的应用。

背景技术

疫苗免疫失败是猪瘟病毒(CSFV)不断复发和流行的一个重要原因。临床上造成CSFV免疫失败的主要原因除了不合理的免疫程序、母源抗体干扰、持续性感染造成的免疫耐受，还有猪群中其它病原感染造成的免疫抑制。猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)作为免疫抑制性病原，在兽医临床具有很高的检出率。有流行病学调查显示，有15.87％的猪场中存在CSFV-PRRSV共感染，有13.06％的猪场中存在CSFV-PCV2共感染，甚至CSFV-PRRSV-PCV2三重感染的猪场也达到了9.53％，这很可能是PCV2和PRRSV相关的免疫抑制引起的。以PCV2为例，其对淋巴组织具有首选的细胞噬性，从而负调节胸腺中T细胞选择过程，导致病猪明显的淋巴耗竭和免疫抑制。这些免疫抑制性因素的存在使得CSFV的防控和净化更加困难。因此，研发二联疫苗针对CSFV和这些免疫抑制性病原同时免疫，可能是一种可供选择的防控策略。

Cap蛋白是PCV2唯一的衣壳蛋白。PCV2病毒样颗粒(VLPs)由60个Cap单体组装而成，并已成功开发作为商品化疫苗预防PCV2感染。这些疫苗接种后可显著缓解与PCV2相关的临床症状和病理变化。目前，已有研究表明PCV2 VLP可作为有效的抗原载体来递送外源蛋白或表位，从而诱导针对外源性抗原的免疫反应。研究人员通过将外源多肽融合在PCV2Cap的N端或C端，从而构建多种基于Cap融合蛋白的嵌合PCV2 VLPs[191,249]。值得注意的是，这些融合蛋白并未损害PCV2 Cap骨架的自组装能力。然而，由于Cap N端隐藏在衣壳内并参与组装后的病毒基因组包装，融合在PCV2 Cap的N端的外源多肽很可能也被包埋，而不会展示在嵌合PCV2 VLP的表面。外源多肽插入到Cap的C末端构建的嵌合PCV2 VLPs，免疫后可在猪体和小鼠中同时诱导针对PCV2 Cap和外源多肽的抗体。因此，Cap的C端适合插入外源多肽构建嵌合PCV2 VLPs，可应用于开发多联疫苗。

然而，以上嵌合PCV2 VLPs的研究仅限于通过基因融合的方式，递送的外源抗原也仅限于多肽。目前还没有研究报道携带较大外源蛋白的嵌合PCV2 VLPs疫苗。利用基因融合将外源表位或多肽整合到VLPs中很大程度上受限于插入多肽的大小和空间结构，插入分子量大、三维结构复杂的蛋白质往往对VLP组装、溶解性、蛋白质折叠以及VLP稳定性造成负面影响。由于CSFV E2结构复杂，有很多中和表位都是构象依赖的，因此E2的正确折叠直接关系到免疫保护效力。新出现的SpyCatcher/SpyTag技术结合了基因融合和标签偶联的优势，可允许在VLP上展示分子量更大且结构更复杂的蛋白质。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术中的不足，为了更好地防控CSFV和PCV2的混合感染，提出了一种基于PCV2 VLP的二联疫苗研发策略。