[发明专利]大鼠线粒体基因aC（aCC）位点特异性碱基编辑及其应用

说明书

大鼠线粒体基因aC(aCC)位点特异性碱基编辑及其应用。本发明利用DdCBE碱基编辑技术，针对aC(aCC)位点，在其两侧设计TALE识别靶点序列，通过筛选四种DdCBE组合方式，鉴定出具有aC(aCC)位点特异性的DdCBE组合(L1333C+R1333N)；通过大鼠受精卵显微注射，能够实现大鼠线粒体基因第007位aC靶点C·G到T·A的突变；携带该突变的F₀雌性大鼠与野生型雄性大鼠杂交进行传代分析，证明获得的突变能够稳定的母系遗传；进一步的行为学和心脏功能评价证实该大鼠模型具有人类线粒体同源位点突变疾病表型。

技术领域

本发明涉及动物基因遗传修饰，具体涉及一种大鼠线粒体基因aC(aCC)位点特异性的碱基编辑工具及其应用。

背景技术

线粒体是唯一拥有自己遗传物质(线粒体DNA，mtDNA)的细胞器。mtDNA突变与人类多种系统性疾病相关。目前为止，已报道人类疾病相关的mtDNA突变超过390种，并且数量还在不断增加。但是，临床目前仍没有针对mtDNA突变所致疾病的特异性治疗药物。因此，迫切需求包含精确的人类mtDNA变异的动物模型来揭示这类疾病的病理生理学过程并开发针对这些疾病的治疗方法。由于传统DdCBE工具的识别靶点只局限于tC位点，严重地限制了DdCBE工具的应用。因此，开发能够识别非tC(aC/cC/gC)位点的DdCBE工具，对于建立对应的mtDNA突变动物模型，服务于基础和临床研究至关重要。

发明内容

本发明的目的之一是开发一种实现大鼠mtDNA aC(aCC)位点C·G到T·A的编辑工具。

根据本发明的第一方面内容，提供一种大鼠mtDNA aC(aCC)位点C·G到T·A的编辑工具，包括：

根据目标mtDNA突变位点，在其上下游各选定一个TALE识别靶点，TALE识别靶点序列之间的间隔为7-18bp；

筛选能够高效率的定位到目标aC(aCC)位点使其发生C·G到T·A转变的DdCBE组合，从而在大鼠线粒体基因组中引入突变。

本发明针对传统DdCBE只能实现tC位点编辑的局限性，通过优化DdCBE组合，扩展其在大鼠中的识别位点，从而提供了一种能够实现aC(aCC)位点特异性编辑的DdCBE工具。

其中所述特异性的DdCBE组合被共注射以实现大鼠线粒体目标aC位点碱基C·G到T·A的突变。

根据本发明，大鼠mtDNA aC(aCC)位点特异性DdCBE组合为：

Rat aC(aCC)Left TALE-G1333C(L1333C)和Rat aC(aCC)Right TALE-G1333N(R1333N)

根据本发明，可以实现大鼠mtDNA aC(aCC)位点碱基C·G到T·A的突变。

根据本发明的第二方面，提供了上述编辑工具在大鼠受精卵中进行mtDNA G007A的突变应用。

根据本发明的另一方面，还提供了一种试剂盒，包括上述碱基编辑工具或系统。

根据本发明方法制备的mtDNA G007A F₀雌性突变大鼠，与野生型雄性大鼠交配，在子代大鼠中能够检测到mtDNA G007A突变。

根据本发明建立的mtDNA G007A突变大鼠，通过行为学和心脏功能分析，证明mtDNA G007A突变大鼠模型能够模拟人mtDNA G583A突变的临床表型。

附图说明

图1人和大鼠线粒体致病突变aC(aCC)位点同源比对；

图2不同DdCBE组合在C6细胞中对aC(aCC)位点编辑效率的比较；