[发明专利]一种低温高活力碱性蛋白酶突变体及其应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及通过重叠PCR技术进行迭代饱和突变获得酶活力提高的碱性蛋白酶酶突变体及其制备与应用。本发明利用重叠PCR技术对克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶基因apr进行迭代饱和突变，筛选出低温下高活力的突变体，并在解淀粉芽孢杆菌中进行高效表达和制备，解决了低温洗涤环境下碱性蛋白酶活性较低的问题。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及通过重叠PCR技术进行迭代饱和突变获得酶活力提高的碱性蛋白酶酶突变体及其制备与应用。

技术背景：

蛋白酶广泛存在于动物、植物和微生物中，由于微生物具有生长速度快，生长条件简单、代谢过程特殊和分布广等特点，使之成为生物酶的重要来源。其应用主要围绕其水解蛋白质肽键的功能展开，生产生活中，有几个主要的需求：使复杂的大分子蛋白质结构变成简单的小分子肽链或者氨基酸，从而变得易于吸收或洗去，比如食品、洗涤剂、饲料等领域；部分破坏蛋白质结构，使物质组分之间实现分离，这在皮革、丝绸等含蛋白质丰富的材料加工时十分有效；促进环境污染物降解，用于环保领域。蛋白酶既能催化水解反应，也能催化其逆反应，而且具备高度的活性和专一性，非常适合医药工业对某些特定分子的生产需求。

按照最适pH值的不同，蛋白酶可分为碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶。碱性蛋白酶的最适pH为8.0-11.0，其多来源于微生物，特别是工业微生物产生的碱性蛋白酶其水解能力与耐碱性具有更加明显的优势，与动植物来源的碱性蛋白酶相比，微生物碱性蛋白酶可分泌到细胞外，具有下游技术处理相对简单，价格低廉、来源广、菌易培养、同时易于实现工业化大批量生产等特点，因此，碱性蛋白酶研究已成为蛋白酶研究的热点。然而，酶活力不高仍是当前碱性蛋白酶工业化生产的一个最主要的限制因素，因此，开发高活力碱性蛋白酶对其实现工业化生产具有重要意义。洗涤剂的pH一般在9.0-11.0，碱性蛋白酶由于其在碱性条件下具有较高的稳定性和活性，被主要应用于洗涤剂行业，它们在洗涤剂配方中的使用占其总销售额的89％。碱性蛋白酶由于其广泛的应用，受到了越来越多研究者的关注，人们致力于挖掘具有独特性质和更高活性的新型碱性蛋白酶。

丝氨酸碱性蛋白酶是工业洗涤剂中最重要的酶类之一，约占微生物酶总销售额的35％。第一个含有细菌蛋白酶的商业洗涤剂是由Gebrüder schnyder在1959年生产的。近年来，市场上的液体洗涤剂比固体洗涤剂更受到消费者的欢迎。在洗涤剂中加入碱性蛋白酶能保持衣物原有的颜色，提高产品的去污能力，降低表面活性剂的添加量，还能有节水、节能和环保的作用。根据调查结果显示，我国的洗衣温度通常集中在10-20℃之间，而目前市售的洗涤剂中添加的蛋白酶大多为中温碱性蛋白酶，其最适温度为40-60℃。天然的低温碱性蛋白酶在高于20℃的温度下稳定性差且大规模生产时产量低，使得这类酶通常不能满足洗涤行业对低温碱性蛋白酶的需求。基于以上背景，通过对克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶(ALK)进行分子改造，筛选低温下高活力的ALK突变体，以满足目前洗涤行业的需求。

蛋白质定向进化的本质是构建分子多样性文库以及从文库中筛选到性状有改进的突变体，根据文库构建原理的不同，可分为随机进化、改组技术、半理性进化和理性进化四种策略，其大致思路均为由某一靶基因或一族相关的家族基因起始，通过对编码基因进行突变或重组，创建分子多样性文库；筛选文库获得能够编码改进性状的基因，作为下一轮进化的模板；在短时间内完成自然界中需要成千上万年的进化，从而获得具有改进功能或全新功能的蛋白质。对酶分子的设计与改造方面，是基于基因工程、蛋白质工程和计算机技术互补发展和渗透的结果，它标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造酶分子，甚至设计出自然界中原来并不存在的全新的酶分子。酶分子人为改造还不成熟的情况下，通过定点突变技术改造成功了大量的酶分子，获得了比天然酶活力更高、稳定性更好的工业用酶。重叠PCR技术(Overlap PCR)，是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。运用这项技术对基因序列进行定点突变，从而实现对蛋白质的定向改造，是合理且实用的。