[发明专利]一种外泌体蛋白检测方法

权利要求书

1.一种外泌体蛋白检测方法，其特征在于，采用大比表面积的纳米级磁性微球与抗体结合，以增加抗体结合位点；通过多色荧光微球标记不同的外泌体蛋白，结合流式细胞术快速进行外泌体提取及蛋白检测的方法，包括以下步骤：

（1）磁珠与抗体连接：

称取100 mg 纳米磁性颗粒充分溶解于1 mL浓度为20 mM且pH 6的 PBS缓冲液中得到磁球分散溶液；上述溶液中加入0.5 mL 浓度为20 mM 的EDC与0.5 mL 浓度40 mM的NHS，充分混合均匀，25℃对磁球活化30 min；活化后的磁珠磁吸除去上清液，用PBS彻底清洗后，再加入1 mL 浓度10 mM且pH 7的PBS缓冲液；取10~100 μL浓度为1 mg/mL的 抗体加入活化后的磁珠，混合均匀后25℃反应过夜；反应结束后，磁吸除去上清液，采用含0.1% 吐温-20的浓度10 mM且pH 7的PBS彻底清洗后，加入0.1% BSA、0.01%酪蛋白，0.1% 吐温-20 的浓度10mM且pH 7的PBS缓冲液，25℃反应30 min后磁吸去除上清，彻底清洗后，加入1 mL 0.1%BSA、0.1% 吐温-20 的PBS（10 mM，pH 7），4℃保存，记为抗体标记磁珠；

（2）荧光微球与抗体连接：

称取100 mg荧光微球充分溶解于1 mL 浓度20 mM且pH 6的PBS缓冲液得到荧光微球溶液；该溶液中加入0.5 mL 20 mM EDC与0.5 mL 40 mM的NHS，充分混合均匀，25℃活化荧光微球30 min；活化后的荧光微球离心去上清液，PBS彻底清洗，加入1 mL 浓度10 mM且pH 7的PBS缓冲液；取10~100 μL浓度为 1 mg/mL的抗体加入活化后的荧光微球，混合均匀后25℃反应过夜；反应结束后，离心除去上清液，采用含0.1% 吐温-20的10 mM且pH7的PBS彻底清洗后，加入0.1% BSA、0.01%酪蛋白，0.1% 吐温-20 的10 mM且pH7的PBS，25℃反应30 min后离心去除上清，彻底清洗后，加入1 mL 0.1% BSA、0.1% 吐温-20 的PBS（10 mM，pH7），4℃保存，记为抗体标记荧光微球；

（3）外泌体分离与荧光微球标记：

取新鲜提取外泌体、溶液Ⅰ与10 mM，pH7的PBS混合均匀，总体积为100 μL， 25℃反应1~4 h后，磁吸去除上清液，PBS彻底清洗，加入100 μL的 10 mM且pH7的PBS；上述溶液中加入洗脱液，25℃反应1h，磁吸，保留上清液；上清液中加入溶液Ⅱ，25℃反应1h，离心除去上清液，PBS彻底清洗，加入100 μL的10 mM且pH7的 PBS；

（4）流式细胞术检测：用流式细胞仪对荧光标记的微球进行检测：

采用校准样品进行标准操作校准仪器，采用488 nm激光光源、荧光信号对荧光标记的微球进行检测。

2.根据权利要求1所述外泌体蛋白检测方法，其特征在于，所述的磁性纳米颗粒尺寸在100~500 nm。

3.根据权利要求1所述外泌体蛋白检测方法，其特征在于，所述的抗体为Ig G、CD9、CD63、CD81、TSG101中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述外泌体蛋白检测方法，其特征在于所述的荧光微球采用488 nm激光光源，荧光信号分别为530 nm、与580 nm与630 nm。

5.根据权利要求1所述外泌体蛋白检测方法，其特征在于所述的洗脱液成分为100 mM的β-巯基乙醇、2%的SDS、62.5 mM 的Tris-HCl。